人类胰岛的分离：第一部分：收集和胰腺组织消化
Summary
实现高品质和适当数量的人类胰岛是胰岛移植成功的突出的先决条件之一。在这个视频中，我们描述一步一步人体胰岛隔离的程序：使用修改的自动化方法（第一部分消化和胰腺组织的集合）。
Abstract
1型糖尿病的管理负担，既要对个人和社会，每年耗资超过100亿美元。尽管血糖监测和新的胰岛素制剂的广泛使用，许多人仍然发展毁灭性的继发性并发症。胰岛移植可以恢复接近正常的糖尿病患者血糖控制<sup> 1</sup>胰岛素强化治疗相关的严重的低血糖发作的危险，没有。胰岛移植成功的，重要的是提供足够的胰岛质量。但是，捐助者的特点，器官获取和保存的影响隔离的结果<sup> 2</sup>。我们在美国伊利诺伊大学芝加哥分校（UIC）的开发与改进的净化梯度，成功的隔离协议<sup> 3</sup>。该计划开始于2004年1月，2008年11月超过300隔离。 “胰腺被送往在冷保存液（UW液，威斯康星州或HTK的大学，组氨酸，色氨酸酮戊二酸）<sup> 4-7</sup>在UIC的细胞分离胰岛隔离的实验室。使用UIC的方法，这是最初所Ricordi描述的方法修改后的版本中分离出胰岛<em>等</em><sup> 8</sup>。简言之，清洗后的胰腺周围组织灌注与酶液（赛瓦胶原酶+中性蛋白酶或Sigma V酶）。扩张的胰腺，然后转移到Ricordi消化腔，连接到一个修改过的，封闭的的循环管路系统，并升温至37 ° C。在消化，香港总商会是轻轻的动摇。样品连续监测的消化进度。一旦获得了自由的胰岛细胞，在显微镜下发现，消化停止刷新冷（4℃）的RPMI稀释液稀释的酶进入流通系统（Mediatech，赫恩登，VA）。正在收集和M199媒体补充人血白蛋白洗净后，组织样本进行预净化计数和培养威斯康星解决方案之前，净化。第二部分：人类胰岛的分离纯化及文化，净化过程中，将描述。
Protocol
1。设备安装人胰岛分离是一个时间敏感的程序，涉及团队精神，因此，四个人都需要进行此步骤。该小组是导致受术者，剖析和cannulates胰腺。 胰岛隔离分钟开始，球队进入UIC的胰岛隔离设施。小组成员，确保一切必要的检测仪器，如离心机，检查并打开。他们还确保消毒所有的油烟机和表面。 两个人将成立插管表，雪泥机，消化电路，灌注单元，COBE净化机，手术表。 …
Discussion
有多种因素影响隔离的结果9,10。其中，消化胰腺组织中起着突出的作用。基于我们自己的人胰岛隔离的经验，我们总结了以下关键点，这有可能影响胰岛的产量和质量。
- 时利用不同类型的酶，消化时间是不同的。
- 只要完全从胰腺组织中分离胰岛的40-50％，消化应立即停止加入稀释液，冷却下来的组织。
- 柔和的组织处理，收集，洗涤，和混合。
- 收集组织和UW液的混合?…
Acknowledgements
在伊利诺伊大学芝加哥分校以及胰岛细胞资源中心美国国立卫生研究院授予（05-003 RFA – RR），克里斯托弗基金会，该Efroymson基金会，和泰乐基金会的资金支持。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ice Slush Machine | equipment | Taylor Company | K4036546 | make sterile ice |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter | 424803 | |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Diagnostic Instrument Co | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nunc Brand Products | 174926 | islet counting |
| Digital Water Bath EX7 | equipment | NesLab | 105361058 | |
| Thermometer | equipment | IBI:IR | 60444 | |
| MonoBloc Balance AB 104-S | equipment | Metler Toledo | 1119430864 | measure pancreas weight |
| MasterFlex II Speed Controller | equipment | Cole Parmer Instrument Co | J00006445 | adjust flow speed during degestion |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon | 217267 | |
| Perfusion Unit | equipment | Custom Made/Swiss | n/a | |
| Cooler for perfusion unit | equipment | Fisher Scientific | 3013P | |
| Ricordi Chamber | equipment | University of Miami | n/a | |
| RPMI dilution solution | reagent | Mediatech Inc | 99783024 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech Inc | 99-597-CM | |
| 25% Human Albumin | reagent | GRIFOLS | NDC 61953-0002-2 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech Inc | 99-784-CM | |
| Collagenase NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002937 | |
| Neutral Protease NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002936 | |
| Betadine | reagent | Cardinal Health | 29906-004 | |
| Cefazolin | reagent | West-Ward Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Dithizone | reagent | Sigma | D5130 |
References
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- Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A., et al. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S., et al. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
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- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38, 140-142 (1989).
- Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85, 950-955 (2008).
- Toso, C., et al. Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).
Tags
Human Pancreatic Islet IsolationDigestionCollectionType 1 DiabetesGlucose ControlInsulin TherapyIslet TransplantationDonor CharacteristicsOrgan ProcurementPreservationIsolation ProtocolPurification GradientCold Preservation SolutionsCell Isolation LaboratoryUIC MethodRicordi Et Al MethodEnzyme Solution
Cite This Article
Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125, doi:10.3791/1125 (2009).