בידוד האדם לבלב: אני חלק: העיכול אוסף של רקמת לבלב
Summary
השגת איכות גבוהה וכמות נאותה של איים האנושי הוא אחד התנאים המוקדמים הבולטים איון להשתלה מוצלחת. בסרטון הזה, אנו מתארים צעד אחר צעד את נוהלי בידוד איון האדם הלבלב (אני חלק: העיכול אוסף של רקמת לבלב) בשיטה אוטומטית שונה.
Abstract
ניהול של סוכרת מסוג 1 היא מעיקה, הן הפרט והחברה, עולה מעל 100 מיליארד דולר בשנה. למרות השימוש הנרחב של ניטור גלוקוז אינסולין ניסוחים חדשים, אנשים רבים עדיין לפתח סיבוכים משניים הרסנית. איון השתלת הלבלב יכול לשחזר ליד בקרת גלוקוז נורמלי אצל חולי סוכרת<sup> 1</sup>, בלי הסיכון של התקפי היפוגליקמיה חמורים הקשורים בטיפול אינטנסיבי באינסולין. מתן המוני איון מספיק חשוב איון השתלה מוצלחת. עם זאת, מאפיין התורם, רכש איברים ושימור להשפיע על התוצאה בידוד<sup> 2</sup>. באוניברסיטת אילינוי בשיקגו (UIC) פיתחנו פרוטוקול בידוד מוצלח עם שיפוע טיהור משופרת<sup> 3</sup>. התוכנית החלה בינואר 2004, ויותר מ -300 isolations בוצעו עד נובמבר 2008. Pancreata נשלחו בקור פתרונות שימור (UW, אוניברסיטת ויסקונסין או HTK, היסטידין-טריפטופן Ketoglutarate)<sup> 4-7</sup> אל המעבדה תא בידוד בבית UIC לבידוד איון. איי הלבלב בודדו בשיטת UIC, שהיא גירסה שונה של השיטה המתוארת במקור על ידי Ricordi<em> ואח'</em><sup> 8</sup>. בקצרה, לאחר ניקוי הלבלב מן הרקמה הסובבת, זה היה perfused עם פתרון אנזים (Serva collagenase + ניטרלי פרוטאז או סיגמא האנזים V). הלבלב נפוחה ואז הועברה לתא העיכול Ricordi, המחובר שונה, מערכת הדם בצינור סגור, וחיממה עד 37 ° C. במהלך העיכול, החדר היה מזועזע בעדינות. דוגמאות נלקחו ברציפות כדי לפקח על התקדמות העיכול. לאחר איים חינם התגלו מתחת למיקרוסקופ, את מערכת העיכול נעצר על ידי שטיפה קר (4 ° C) RPMI פתרון הדילול (Mediatech, הרנדון, VA) לתוך מערכת הדם לדלל את האנזים. לאחר שנאספו לרחוץ M199 התקשורת בתוספת אלבומין אדם, רקמת נדגמה עבור לספור טיהור טרום מודגרות עם פתרון UW לפני הטיהור. תהליך טיהור שיפורט בחלק ב ': טיהור והתרבות של איי האדם.
Protocol
Discussion
ישנם מגוון גורמים המשפיעים על התוצאה בידוד 9,10. ביניהם, עיכול של רקמת הלבלב תפקיד בולט. בהתבסס על הניסיון שלנו איון אדם בבידוד, סיכמנו הבאים נקודות קריטיות, אשר עלול להשפיע על איכות תשואה איון ו.
- זמן עיכול שונה, כאשר סו?…
Acknowledgements
נתמכים על ידי מימון מאוניברסיטת אילינוי בשיקגו, כמו גם משאבים איילט Cell מרכז NIH מענק (RFA-RR 05-003), קרן כריסטופר, קרן Efroymson, וקרן Tellabs.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ice Slush Machine | equipment | Taylor Company | K4036546 | make sterile ice |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter | 424803 | |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Diagnostic Instrument Co | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nunc Brand Products | 174926 | islet counting |
| Digital Water Bath EX7 | equipment | NesLab | 105361058 | |
| Thermometer | equipment | IBI:IR | 60444 | |
| MonoBloc Balance AB 104-S | equipment | Metler Toledo | 1119430864 | measure pancreas weight |
| MasterFlex II Speed Controller | equipment | Cole Parmer Instrument Co | J00006445 | adjust flow speed during degestion |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon | 217267 | |
| Perfusion Unit | equipment | Custom Made/Swiss | n/a | |
| Cooler for perfusion unit | equipment | Fisher Scientific | 3013P | |
| Ricordi Chamber | equipment | University of Miami | n/a | |
| RPMI dilution solution | reagent | Mediatech Inc | 99783024 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech Inc | 99-597-CM | |
| 25% Human Albumin | reagent | GRIFOLS | NDC 61953-0002-2 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech Inc | 99-784-CM | |
| Collagenase NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002937 | |
| Neutral Protease NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002936 | |
| Betadine | reagent | Cardinal Health | 29906-004 | |
| Cefazolin | reagent | West-Ward Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Dithizone | reagent | Sigma | D5130 |
References
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Nano, R., et al. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
- Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A., et al. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S., et al. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P., et al. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38, 140-142 (1989).
- Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85, 950-955 (2008).
- Toso, C., et al. Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).
