人間の膵島単離：パートI：膵組織の消化とコレクション
Summary
ヒト膵島の高品質と適切な量を達成することが成功した膵島移植のための著名な前提条件の一つです。このビデオでは、我々は段階的に説明し、人間の膵島を分離するための手順：変更された自動化法を用いて（パートI消化および膵組織のコレクション）。
Abstract
1型糖尿病の管理は、年間1,000億ドルで、個人と社会の両方に、厄介です。グルコースモニタリングと新しいインスリン製剤の普及にもかかわらず、多くの個人はまだ壊滅的な二次的合併症を開発する。膵島移植は、糖尿病患者における正常血糖コントロールの近くに復元することができます<sup> 1</sup>、集中的なインスリン療法に関連付けられている重篤な低血糖エピソードのリスクなし。十分な膵島質量を提供することに成功した膵島移植のために重要です。しかし、ドナーの特性、臓器の調達と保存には、分離結果に影響を及ぼす<sup> 2</sup>。イリノイ大学シカゴ校（UIC）で我々は改善された精製勾配で成功した分離プロトコルを開発している<sup> 3</sup>。プログラムは、2004年1月に開始し、300人以上のアイソレーションは、2008年11月までに実施された。膵臓は冷たい保存液（UW、ウィスコンシン州またはHTKの大学、ヒスチジン – トリプトファンケトグルタル酸）に送られ、<sup> 4月7日</sup>膵島分離のためのUICにおける細胞分離の研究室へ。膵島は、もともとRicordiの記載された方法を改変したものですUIC方法を、用いて単離された<em>ら</em><sup> 8</sup>。簡単に言えば、周囲の組織から膵臓をクリーニングした後、それは酵素溶液（Servaコラゲナーゼ+中性プロテアーゼまたはシグマV酵素）で灌流した。膨張した膵臓は、その後、Ricordiの消化槽に移し、変更、閉鎖循環配管システムに接続し、37℃まで加温した。消化中に、チャンバーを穏やかに振とうした。サンプルは、消化の進行状況を監視するために連続して撮影した。無料の島が顕微鏡下で検出された一度、消化酵素を希釈する循環システムへのコールド（4℃）RPMI希釈液（Mediatech、ハーンドン、バージニア州）をフラッシュして停止した。収集し、ヒトアルブミンを添加したM199培地で洗浄した後、組織は、事前に精製数をサンプリングし、精製前のUW液でインキュベートした。ヒト膵島の精製と文化：精製工程は、第II部で説明される。
Protocol
Discussion
分離の結果9,10に影響を与える要因はさまざまです。その中で、膵組織の消化は、重要な役割を果たしている。私たち自身の人間の膵島分離の経験に基づいて、我々は潜在的に膵島の収量と品質に影響を与えうる重要なポイントは、以下の要約。
- 酵素の様々なタイプが使用されると消化時間が異なっている。
- 早く完全に腺房組織から分離膵島の40〜50％として、消化が希釈溶液…
Acknowledgements
イリノイ大学シカゴ校だけでなく、膵島細胞リソースセンターNIHの助成金（RFA – RR 05から003）、クリストファー財団、Efroymson財団、およびテラブス財団からの資金によって支え。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ice Slush Machine | equipment | Taylor Company | K4036546 | make sterile ice |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter | 424803 | |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Diagnostic Instrument Co | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nunc Brand Products | 174926 | islet counting |
| Digital Water Bath EX7 | equipment | NesLab | 105361058 | |
| Thermometer | equipment | IBI:IR | 60444 | |
| MonoBloc Balance AB 104-S | equipment | Metler Toledo | 1119430864 | measure pancreas weight |
| MasterFlex II Speed Controller | equipment | Cole Parmer Instrument Co | J00006445 | adjust flow speed during degestion |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon | 217267 | |
| Perfusion Unit | equipment | Custom Made/Swiss | n/a | |
| Cooler for perfusion unit | equipment | Fisher Scientific | 3013P | |
| Ricordi Chamber | equipment | University of Miami | n/a | |
| RPMI dilution solution | reagent | Mediatech Inc | 99783024 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech Inc | 99-597-CM | |
| 25% Human Albumin | reagent | GRIFOLS | NDC 61953-0002-2 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech Inc | 99-784-CM | |
| Collagenase NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002937 | |
| Neutral Protease NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002936 | |
| Betadine | reagent | Cardinal Health | 29906-004 | |
| Cefazolin | reagent | West-Ward Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Dithizone | reagent | Sigma | D5130 |
References
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- Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A., et al. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S., et al. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P., et al. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
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- Toso, C., et al. Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).
