Изоляция человека Островок поджелудочной железы: Часть I: Пищеварение и сбор ткани поджелудочной железы
Summary
Достижение высокого качества и соответствующего количества человеческих островков является одним из видных предпосылки для успешной трансплантации островок. В этом видео мы опишем шаг за шагом процедуры человеческой изоляции островков поджелудочной железы (часть I: пищеварение и сбор ткани поджелудочной железы), с помощью модифицированного метода автоматизированного.
Abstract
Управление диабетом 1 типа является обременительной, как для личности и общества, стоимостью более 100 миллиардов долларов в год. Несмотря на широкое использование мониторинга уровня глюкозы и новые формулировки инсулина, многие люди по-прежнему развиваться разрушительных вторичных осложнений. Трансплантация островков поджелудочной железы может восстановить около нормы контроля уровня глюкозы у больных сахарным диабетом<sup> 1</sup>, Без риска серьезных эпизодов гипогликемии, которые связаны с интенсивной инсулинотерапии. Обеспечение достаточной массы островок имеет важное значение для успешной трансплантации островок. Тем не менее, доноры характеристики, обеспечения органами и сохранение влияют изоляции результат<sup> 2</sup>. В Университете Иллинойса в Чикаго (UIC) мы разработали успешную протокол изоляции с улучшенной градиент очистки<sup> 3</sup>. Программа была начата в январе 2004 года, и более 300 выделений проводились до ноября 2008 года. Pancreata были отправлены в холодной решения сохранение (ВУ, Университет Висконсин или НТК, гистидин-триптофан кетоглутарат)<sup> 4-7</sup> Для лабораторных клеточных изоляции в МСЖД для изоляции островок. Панкреатических островков были изолированы с помощью МСЖД метод, который представляет собой модифицированный вариант метода первоначально описывается Ricordi<em> И др.</em><sup> 8</sup>. Короче говоря, после чистки поджелудочной железы от окружающих тканей, он был озарен раствора фермента (Serva Коллагеназа + нейтральные протеазы или Sigma V фермента). Растянутый поджелудочной железы был переведен в камеру пищеварения Ricordi, связанные с изменение, замкнутая система циркуляции трубы, и нагревают до 37 ° C. Во время пищеварения, камера была потрясена мягко. Пробы были взяты непрерывно контролировать пищеварение прогресса. Как только свободные островки были обнаружены под микроскопом, пищеварения был остановлен промывка холодной (4 ° С) RPMI разбавления раствора (Mediatech, Херндон, В. А.) в системе циркуляции, чтобы разбавить фермента. После того, как собирают и промывают в M199 среде с человеческий альбумин, ткани, отобранных для предварительной очистки считать и инкубировали с UW решение до очистки. Процесс очистки будут описаны в Части II: Очистка и культуры прав островков.
Protocol
Discussion
Есть множество факторов, влияющих на изоляцию результат 9,10. Среди них, переваривания ткани поджелудочной железы играет важную роль. Исходя из нашего собственного человеческого опыта изоляции островке, мы кратко изложены следующие критические точки, которые потенциально могут влиять …
Acknowledgements
Поддержка финансирования из университета Иллинойса в Чикаго, а также островковых клеток ресурсный центр NIH грант (RFA-RR 05-003), Кристофер Фонда Efroymson Фонда, а Фонд Tellabs.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ice Slush Machine | equipment | Taylor Company | K4036546 | make sterile ice |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter | 424803 | |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Diagnostic Instrument Co | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nunc Brand Products | 174926 | islet counting |
| Digital Water Bath EX7 | equipment | NesLab | 105361058 | |
| Thermometer | equipment | IBI:IR | 60444 | |
| MonoBloc Balance AB 104-S | equipment | Metler Toledo | 1119430864 | measure pancreas weight |
| MasterFlex II Speed Controller | equipment | Cole Parmer Instrument Co | J00006445 | adjust flow speed during degestion |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon | 217267 | |
| Perfusion Unit | equipment | Custom Made/Swiss | n/a | |
| Cooler for perfusion unit | equipment | Fisher Scientific | 3013P | |
| Ricordi Chamber | equipment | University of Miami | n/a | |
| RPMI dilution solution | reagent | Mediatech Inc | 99783024 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech Inc | 99-597-CM | |
| 25% Human Albumin | reagent | GRIFOLS | NDC 61953-0002-2 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech Inc | 99-784-CM | |
| Collagenase NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002937 | |
| Neutral Protease NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002936 | |
| Betadine | reagent | Cardinal Health | 29906-004 | |
| Cefazolin | reagent | West-Ward Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Dithizone | reagent | Sigma | D5130 |
References
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Nano, R., et al. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
- Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A., et al. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S., et al. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P., et al. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38, 140-142 (1989).
- Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85, 950-955 (2008).
- Toso, C., et al. Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).
