Mänskliga Pancreatic Islet Isolering: Del I: Matsmältning och Insamling av pankreas vävnad
Summary
Uppnå hög kvalitet och lämplig mängd mänskliga skär är en av de framstående förutsättningarna för en framgångsrik ö-transplantation. I denna video beskriver vi steg för steg förfarandena för mänskliga bukspottkörteln holme isolering (del I: matsmältningen och samling av bukspottskörteln vävnad) med hjälp av en modifierad automatiserad metod.
Abstract
Hantering av typ 1 diabetes är betungande, både för individen och samhället, kostar över 100 miljarder dollar årligen. Trots den utbredda användningen av glukos övervakning och nya formuleringar insulin, många individer utvecklar fortfarande förödande sekundära komplikationer. Pankreas ö-transplantation kan återställa nära normal blodsockerkontroll hos diabetespatienter<sup> 1</sup>, Utan risk för allvarliga hypoglykemiska episoder som är förknippade med intensiv insulinbehandling. Ger tillräcklig holme massan är viktig för en framgångsrik ö-transplantation. Men donator karakteristiska, tillvaratagandet av organ och konservering påverkar isoleringen resultatet<sup> 2</sup>. Vid University of Illinois i Chicago (UIC) har vi utvecklat ett framgångsrikt isolering protokoll med en förbättrad rening gradient<sup> 3</sup>. Programmet startade i januari 2004, och mer än 300 isoleringar utfördes fram till november 2008. Den pancreata sändes i kallt konserveringslösningar (UW, University of Wisconsin-eller HTK, histidin-Tryptofan ketoglutarat)<sup> 4-7</sup> Till cellen Isolering Laboratory vid UIC för holme isolering. Pankreasöarna var isolerade med UIC-metoden, som är en modifierad version av den metod som ursprungligen beskrevs av Ricordi<em> Et al</em><sup> 8</sup>. Kortfattat, efter rengöring bukspottkörteln från den omgivande vävnaden, det var perfusion med enzymet lösning (Serva kollagenas + Neutrala Protease eller Sigma V enzym). Den utspänd bukspottkörteln överfördes därefter till Ricordi rötkammaren, kopplad till en modifierad, sluten cirkulation slangsystem och värmts upp till 37 ° C. Under matsmältningen, var kammaren skakas försiktigt. Prover tas kontinuerligt för att övervaka matsmältningen framsteg. När fria holmar upptäcktes under mikroskop var matsmältningen stoppas genom att spola kallt (4 ° C) RPMI utspädning lösning (Mediatech, Herndon, VA) i cirkulationssystem för att späda ut enzymet. Efter att samlas in och tvättas i M199 media kompletteras med humant albumin, var vävnaden provtas för pre-rening räkna och inkuberas med UW-lösning före reningen. Reningsprocessen kommer att beskrivas i Del II: Rening och kultur för mänskliga holmar.
Protocol
Discussion
Det finns en mängd olika faktorer som påverkar isoleringen resultatet 9,10. Bland dem spelar nedbrytning av bukspottkörtelns vävnad en framträdande roll. Baserat på våra egna mänskliga holme isolering erfarenhet, vi sammanfatta följande kritiska punkter, som skulle kunna påverka holmen avkastning och kvalitet.
- Den koktiden är olika när olika typer av enzymer utnyttjas.
- Så snart som 40-50% av de holmar helt skild från acinar vävnad, bör matsmältningen stoppas omedelbart genom att l…
Acknowledgements
Med stöd av medel från University of Illinois i Chicago samt Islet Cell Resource Center NIH bidrag (RFA-RR 05-003), den Christopher Foundation, Efroymson Foundation och Tellabs stiftelsen.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ice Slush Machine | equipment | Taylor Company | K4036546 | make sterile ice |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter | 424803 | |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Diagnostic Instrument Co | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nunc Brand Products | 174926 | islet counting |
| Digital Water Bath EX7 | equipment | NesLab | 105361058 | |
| Thermometer | equipment | IBI:IR | 60444 | |
| MonoBloc Balance AB 104-S | equipment | Metler Toledo | 1119430864 | measure pancreas weight |
| MasterFlex II Speed Controller | equipment | Cole Parmer Instrument Co | J00006445 | adjust flow speed during degestion |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon | 217267 | |
| Perfusion Unit | equipment | Custom Made/Swiss | n/a | |
| Cooler for perfusion unit | equipment | Fisher Scientific | 3013P | |
| Ricordi Chamber | equipment | University of Miami | n/a | |
| RPMI dilution solution | reagent | Mediatech Inc | 99783024 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech Inc | 99-597-CM | |
| 25% Human Albumin | reagent | GRIFOLS | NDC 61953-0002-2 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech Inc | 99-784-CM | |
| Collagenase NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002937 | |
| Neutral Protease NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002936 | |
| Betadine | reagent | Cardinal Health | 29906-004 | |
| Cefazolin | reagent | West-Ward Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Dithizone | reagent | Sigma | D5130 |
References
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Nano, R., et al. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
- Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A., et al. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S., et al. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P., et al. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38, 140-142 (1989).
- Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85, 950-955 (2008).
- Toso, C., et al. Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).
