우리는 총 내부 반사와 epifluorescence 현미경을 사용하여 교양 astrocytes에 막 및 글로벌 세포내 칼슘 역학 근처 측정하는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
두뇌는 glial 세포가 포함되어 있습니다. Astrocytes, glial 세포의 종류는 긴 뉴런에 수동 지원 역할을 제공하는 것으로 알려져 있습니다. 그러나, 증가 증거 astrocytes도 적극적으로 뉴런과 기능적 상호 작용을 통해 뇌의 기능에 참여할 수있다하는 것이 좋습니다. 그러나, astrocyte 생물학의 많은 근본적인 측면 논쟁, 불분명 및 / 또는 실험적으로 미개척 남아있다. 중요한 문제는 astrocytes의 세포내 칼슘 과도의 역학입니다. 칼슘이 잘 중요한 두번째 메신저로 설립되고 있기 때문에 그것이 astrocyte 칼슘 고도가 astrocytes에서 송신기의 릴리스를 실행할 수있는 제안 되었기 때문에이 적합합니다. 그러나, astrocytes의 신호 근처 플라즈마 막 칼슘의 자세한 설명을하거나 만족이되지 않았습니다. 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 살 세포의 플라즈마 막의 약 100 nm의 시간 생리학 관련 신호 이벤트를 분석하는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 TIRF 현미경을 사용하여 거의 동시에 플라즈마 막과 글로벌 세포내 칼슘 역학 근처 모니터링하는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법의 자세한 상세하고 체계적인 응용 프로그램은 astrocyte 칼슘 신호의 정확한 세부 사항에 대해 알리기 위해 가능성이 있습니다. astrocyte 칼슘 역학에 대한 상세한 이해, 어떻게 언제 왜 astrocytes와 뉴런은 칼슘 의존 기능 상호 작용을 거쳐, 이해하는 기초를 제공할 수 있습니다.
Protocol
실험 절차 실험 절차는 다음 단계 현명한 방식으로 설명하는 두 가지 핵심 부분으로 구성됩니다. 1 부 : 준비 HIPPOCAMPAL ASTROCYTE 문화 간단히 혼합 hippocampal astrocyte – 신경 세포의 문화가 잘 설립 프로토콜 1,2,3을 사용하여 준비되었습니다. 우리는 건강 교양 astrocytes를 얻을 수있는 절차를 최적화. 아래에 나열된 모든 절차는 이러?…
Discussion
그것은 astrocytes은 세포 내 칼슘의 고도를 표시 잘 설정됩니다. 이들은 자발적으로 발생하는가의 연결 활동이나 astrocyte 표면 11 수용체를 활성화하기 위해 agonists의 응용 프로그램에 의해 실행하실 수 있습니다. 하나의 중요한 논쟁 문제는 astrocyte 세포 내 칼슘의 고도는 뉴런 11, 12 수용체를 활성화 신호 분자의 릴리스를 실행할 수 있는지 여부입니다. 로 헤이든 7, 13, 11 맥카시 실험실?…
Acknowledgements
이 작품은 일본의 우에하라 기념 재단 (ES)을뿐만 아니라 화이트홀 재단, 신경 장애 및 뇌졸중과 스테인 – 오펜 하이머 엔다우먼트 수상 (BSK)을 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
VWR® Micro Cover Slips, Round, No. 1
Tool
VWR
48380-068
Poly-D-lysine hydrobromide
Reagent
Sigma
P0899
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane
Reagent
Sigma
L2020
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid
Reagent
Invitrogen
14155-063
Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle’s salts, but no L-glutamine or phenol red
Reagent
Invitrogen
51200-038
Penicillin-Streptomycin liquid
Reagent
Invitrogen
15140-122
Sodium pyruvate solution
Reagent
Sigma
S8636
HEPES solution 1 M
Reagent
Sigma
H0887
N-2 Supplement (100X), liquid
Reagent
Invitrogen
17502-048
Horse Serum, Heat-Inactivated
Reagent
Invitrogen
26050-088
PAPAIN-022
Reagent
Worthington
LK003178
Neurobasal™ Medium (1X) Liquid without Phenol Red
Reagent
Invitrogen
12348-017
B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid
Reagent
Invitrogen
17504-044
L-Glutamine-200 mM (100X), liquid
Reagent
Invitrogen
25030-149
Cell Strainers
Tool
BD Biosciences
352350
BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile
Tool
BD Biosciences
353046
NaCl
Reagent
Sigma
S7653
KCl
Reagent
Sigma
P3911
CaCl2 hexahydrate
Reagent
Sigma
21108
MgCl2 hexahydrate
Reagent
Sigma
M2670
HEPES free acid
Reagent
Sigma
H3375
D-(+)-glucose
Reagent
Sigma
G7528
Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO
Reagent
Invitrogen
F-14217
Pluronic® F-127 20% solution in DMSO
Reagent
Invitrogen
P-3000MP
Immersion Oil TYPE DF
Microscope
Cargille
16242
Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 μl volume
Shigetomi, E., Khakh, B. S. Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes. J. Vis. Exp. (26), e1142, doi:10.3791/1142 (2009).