Isolement de protoplastes à partir de tissus de 14 jours d'âge des plantules Arabidopsis thaliana</em
Summary
Cette vidéo montre une procédure permettant d'isoler des protoplastes intacts les tissus à partir de 14 jours d'âge des plants d'Arabidopsis. Étant donné que les protoplastes isolés restent intacts pendant au moins 96h et sont isolées de plants au lieu d'un mois, les plantes matures, cette procédure accélère les essais nécessitant protoplastes intacts.
Abstract
Les protoplastes sont des cellules végétales qui ont eu leurs parois cellulaires enzymatiquement enlevé. Isolement de protoplastes à partir des tissus végétaux différents a été signalé plus de 40 ans<sup> 1</sup> Et a depuis été adapté pour étudier une variété de processus cellulaires tels que la localisation subcellulaire des protéines, l'isolement des organites intacts et ciblées de gènes en double inactivation d'interférence ARN (ARNi)<sup> 2-5</sup>. La plupart des protocoles d'isolement de protoplastes l'utilisation des tissus de feuilles d'Arabidopsis matures (par exemple 35 jours, âgé de plantes)<sup> 2-4</sup>. Nous avons modifié les protocoles existants en utilisant des plants d'Arabidopsis 14 jours d'âge. Dans cette procédure, un gramme de 14 jours d'âge des plants cédé 5 10<sup> 6</sup> -10<sup> 7</sup> Protoplastes qui restent intactes au moins 96 heures. Le rendement de protoplastes à partir de semis est comparable avec des préparations à partir de feuilles d'Arabidopsis mature, mais au lieu de 35-36 jours, l'isolement des protoplastes est achevé en 15 jours. Cela permet de réduire le temps et l'espace chambre de croissance qui sont nécessaires pour isoler les protoplastes lorsque les plantes matures sont utilisés, et accélère les études qui nécessitent l'aval des protoplastes intacts.
Protocol
Discussion
Pour assurer le rendement élevé de protoplastes intacts, il est très important de start-up avec des plantes saines. Utiliser un filtre de stériliser des solutions pour isoler des protoplastes. Rappelez-vous que les protoplastes sont fragiles. Par conséquent, lorsque vous manipulez des protoplastes, ne pas mélanger, pipette ou vortex entre eux vigoureusement, car il va les freiner. Au lieu de cela, le mélange protoplastes par rotation lente ou de l'enregistrement du tube à centrifuger. Les protoplastes décri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Station de l'Université Cornell Agricultural Experiment (CUAES) NYC-125433 Hatch Grant et Cornell Start-Up Subvention accordée aux OKV
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma | M5524 | ||
| Agar | Sigma | A1296 | ||
| Petri Dishes (100x15mm) | Kreckeler Scientific | 82-4001 | ||
| Cellulase (Onozuka R‐10) | RPI Corp | C32200 | ||
| Macerozyme (R10) | RPI Corp | M22010 | ||
| Cheesecloth wipes | Fisher Scientific | 06-665-29 | ||
| Lab Rotator | Fisher Scientific | 1167152Q | ||
| Allegra X‐15R Centrifuge | VWR | 392932 | ||
| Axioskop2 Plus Microscope | Zeiss |
References
- Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
- Chen, S., Halkier, B. A. Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus. J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).
- Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts. Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).
- Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts. Plant Phys. 149, 642-652 (2009).
