Visualisierung der Live- Drosophila Glial-neuromuskulären Synapse mit Fluoreszenzfarbstoffen
Summary
Wir beschriebenen strukturellen Merkmale der Glia-neuromuskuläre Synapsen in einem Roman Inside-out Gewebe Vorbereitung der Live-Larven unter Verwendung von fluoreszierenden Farbstoffen mit der konfokalen Mikroskopie. Wir gekennzeichnet leben Neuronenendigungen mit fluoreszierenden primären Antikörper gegen HRP und auch visualisiert die perisynaptic Raum mit fluoreszierenden Dextrane.
Abstract
Unser Projekt identifiziert GFP-markierten Gliazellen Strukturen an der Entwicklung von Larven zu fliegen neuromuskulären Synapse. Um sich die Entwicklung von Live-Glia-Nerv-Muskel-Synapsen, entwickelten wir eine Larvengewebe Vorbereitung, die Features von Live intakten Larven hatte, sondern hatte auch gute optische Eigenschaften. Das neue Präparat auch für den Zugang von Perfusaten zur Synapse erlaubt. Wir verwendeten Fliegenlarven, eingetaucht in diese künstliche Hämolymphe, und entspannt ihre normale rhythmische Kontraktionen Körper durch Kälte ihnen. Als nächstes werden wir aus der hinteren Segmente der einzelnen Tiere seziert und mit einem stumpfen Insekten pin schob die Mundwerkzeuge rückwärts durch die Leibeshöhle. Diese umgestülpt die Larven Körper Wand, wie aus einer Socke von innen nach außen. Wir haben die Dissektion mit ultra-feinen Sezierung Schere und somit ausgesetzt der viszeralen Seite des Körpers Wand Muskeln. Die Glia-Strukturen an der NMJ ausgedrückt Membran gezielt GFP unter der Kontrolle von Glia-spezifische Promotoren. Die postsynaptischen Membran, die SSR (subsynaptischen Reticula) im Muskel ausgedrückt synaptisch gezielte dsRed. Wir mussten akut Etikett der Motor Neuron-Terminals, der dritte Teil der Synapse. Dazu wandten wir primäre Antikörper gegen HRP, konjugiert mit einem weit rot emittierenden Fluorophor. Zur Prüfung auf Farbstoffdiffusion Eigenschaften in die perisynaptic Raum zwischen den Motoneuronen-Terminals und der SSR, verwendeten wir eine Lösung der großen Dextran-Moleküle konjugiert weit rot emittierenden Fluorophor und sammelte Bilder.
Protocol
Discussion
Dieses Verfahren ermöglicht langfristige Darstellung von Live-markierten Proteine und zelluläre Prozesse. Die in situ Tissue prep beschrieben wir eine intakte und funktionierende ZNS, PNS und Reflex-Schaltungen. Dieses Gewebe prep hat Vorteile gegenüber Standard-Larven fliegen Muskel-Protokolle, in denen die Larven Körperwand Muskel gedehnt (wenn es merken wird). Stretching kann verzerren synaptischen Morphologie und Trigger-Reflex basiert Kontraktionen. Unsere in-und auswendig prep war mechanisch sta…
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde von der CIHR und NSERC finanziert. Wir möchten Barb Jusiak für einen Beitrag zur Schaffung der Fliege-Stämme, dsRed gekennzeichnet SSR (BJ Linie), und der UBC Bio-Imaging-Anlage bestätigen.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| HL-6: Artifical Drosophila hemolymph, with 5 mM L-glutamate added, and 2 mM Calcium. | Reagent | NA | NA | 5 mM L-glutamate blocked muscle contractions. We used Molecular grade L-Glutamate (Sigma). 2 mM Calcium is close to physiological Calcium levels in natural larval hemolymph. References: Macleod et al 2002 and Macleod 2004 |
| Dextran, Alex Fluor 680; 10,000 MW, anionic, fixable | Reagent | Molecular Probes/Invitrogen | D34680 | Use a small volume perfusion chamber to keep the total volume of dye low |
| Anti-HRP-CY5 conjugate (goat) | Reagent | Jackson ImmunoResearc | 123-175-021 | Dilute 2.0 mg into 1 ml ddH2O; aliquot into 4 microliter aliquots. Freeze at –20C. Dilute one aliquot into 100 microliters of HL-6 |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Reagent | Molecular Probes/Invitrogen | A10475 | We prepared a total of 80 micro liters of conjugated primary antibody, and stored as 2 microliter aliquots. We diluted each aliquot into 100 microliter of HL-6 for labeling. |
| Custom Formulated Objective Oil, refractive index 1.3379 | Reagent | Cargill Labs | Custom Formulated | |
| Ultra Fine Forceps | Tool | Fine Science Tolls | 11252-23 or 11295-20 | |
| Spring scissors | Tool | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Ultra fine clipper scissors | Tool | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Perfusion Chamber RC 20 Series | Tool | Warner Instruments | 64-02222 | |
| Spinning Disc confocal | Microscope | Quorum | Quorum Wave FX | Mounted on a Leica DMI6000 Inverted Microscope |
References
- Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M., Atwood, H. L. Synaptic Vesicles: Test for a role in presynaptic Calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
- Macleod, G. T., Hegstro, M., Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast Calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiology. 88, 2659-2663 (2002).
- Morales, M., Ferrus, A., Martinez-Padron, M. Presynaptic calcium-channel currents in normal and csp mutant Drosophila peptidergic terminals. Eur J Neurosci. 11, 1818-1826 (1999).
- Stork, T., Engelen, D., Krudewig, A., Silies, M., Bainton, R. J., Kla¨mbt, C. Organization and Function of the Blood–Brain Barrier in Drosophila. J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).
