Vaccinia Virus Infektion & Temporal analys av Virus Gene Expression: Del 2
Summary
Protokoll för vaccinia infektion av HeLa celler och analys av värd och virus genuttryck. Del 2 av 3.
Abstract
Familjen<em> Poxviridae</em> Består av stora dubbelsträngat DNA som innehåller virus som replikerar endast i cytoplasman av infekterade celler. Medlemmar i<em> Orthopox</em> Släktet inkluderar variola, vilka smittämnen av mänskliga smittkoppor, monkeypox och vaccinia (VAC), den prototypic medlem av viruset familjen. Inom det relativt stora (~ 200 kb) vaccinia genomet, finns tre klasser av gener kodade: tidig, mellan-och sena. Även om alla tre klasser Kopierat av viralt-kodade RNA-polymeraser, serverar varje klass en annan funktion i livscykeln av viruset. Poxviruses utnyttja flera strategier för modulering i den mottagande cellulära miljön under infektion. För att förstå regleringen av både värd och virus genuttryck, har vi utnyttjat genomet-strategier för att analysera avskrift överflöd från både virus och celler värd. Här visar vi infektioner tid under HeLa celler med Vaccinia virus och RNA provtagning vid flera olika tidpunkter efter infektion. Både värd och virus total RNA isoleras och förstärks för hybridisering med microarrays för analys av genuttryck.
Protocol
Discussion
Kritiska steg
En andra omgång av förstärkning rekommenderas inte som fördomar i rad uppgifter har observerats. Blanda försiktigt vid varje enzymatiska steg (1: a och 2: a strand cDNA syntes, IVT) är avgörande för att få bra förstärkning avkastning, som är inkubationstiden för varje enzymatiska steg i rätt temperatur. En PCR-apparat med justerbara uppvärmda lock är att föredra – även avvikelser så små som 2-3 grader under IVT i en luft hybridisering ugn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Whitehead Institute Fellows Fonder
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1753 | For 20 reactions |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1821 | For 100 reactions, in a 96-well format |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | 기타 | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B. Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
