Proteomics, um Proteine interagieren mit P2X2 Ligand-Gated Kationenkanäle Identifizieren
Summary
Wir beschreiben ein einfaches Protokoll zum Gehirn Proteine, die auf die volle Länge C-Terminus von ATP-gated P2X2-Rezeptoren binden zu identifizieren. Der Ausbau und die systematische Anwendung dieses Ansatzes auf alle P2X-Rezeptoren wird voraussichtlich zu einem besseren Verständnis der P2X-Rezeptor Signalgebung führen.
Abstract
Liganden-gesteuerte Ionenkanäle unterliegen synaptischen Kommunikation im Nervensystem 1. Bei Säugetieren gibt es drei Familien von Liganden-gesteuerte Kanäle: die Cys-Schleife, die Glutamat-gesteuerten und der P2X-Rezeptor-Kanäle 2. In jedem Fall bindend des Senders führt zur Öffnung einer Pore, durch die Ionen fließen ihres elektrochemischen Gradienten. Viele Liganden-gesteuerte Kanäle sind auch durchlässig für Kalzium-Ionen 3, 4, die stromabwärts Signalisierung haben Rollen 5 (zB Gen-Regulation), dass die Dauer der Kanalöffnung überschreiten darf. So Liganden-gesteuerte Kanäle können über weite Zeitskalen von wenigen Millisekunden bis Tagen Signal. Angesichts dieser wichtigen Rolle ist es notwendig zu verstehen, wie Liganden-gesteuerte Ionenkanäle sich durch Proteine reguliert werden, und wie diese Proteine können tune-Signalisierung. Neuere Studien legen nahe, dass viele, wenn nicht alle Kanäle kann ein Teil des Proteins Signalkomplexe 6 sein. In diesem Artikel erklären wir, wie die Proteine, die an der C-terminalen Aspekte des P2X2-Rezeptors cytosolischen Domäne binden zu identifizieren.
P2X-Rezeptoren sind ATP-gated Kationen-Kanäle und bestehen aus sieben Untereinheiten (P2X1-P2X7). P2X-Rezeptoren sind weit verbreitet im Gehirn, wo sie vermitteln exzitatorischen synaptischen Transmission und präsynaptischen Erleichterung der Neurotransmitter Release 7 zum Ausdruck gebracht. P2X-Rezeptoren sind in erregbaren und nicht-erregbaren Zellen gefunden und vermitteln wichtige Rollen in neuronalen Signalübertragung, Entzündungen und Herz-Kreislauf-Funktion 8. P2X2-Rezeptoren sind reichlich im Nervensystem 9 und stehen im Mittelpunkt dieser Studie. Jeder P2X-Untereinheit wird angenommen, dass zwei Membran überspannt Segmente (TM1 und TM2) durch einen extrazellulären Bereich 7 und intrazelluläre N-und C-Terminus (Abb. 1a) 7 getrennt zu besitzen. P2X-Untereinheiten 10 (P2X1-P2X7) zeigen 30-50% Sequenzhomologie auf Aminosäure-Ebene 11. P2X-Rezeptoren enthalten nur drei Untereinheiten, die den einfachsten Stöchiometrie unter ionotropen Rezeptoren ist. Der P2X2-C-Terminus besteht aus 120 Aminosäuren (Abb. 1b) und enthält mehrere Protein-Docking-Konsens Standorten unterstützen die Hypothese, dass P2X2-Rezeptors kann Teil Signalkomplexe werden. Doch obwohl mehrere Funktionen, die C-Terminus von P2X2-Rezeptoren 9 zugeschrieben haben keine Studie hat die molekulare Partner beschrieben, dass einige der intrazellulären Seite des Proteins über die volle Länge C-Terminus. In diesem Verfahren Papier beschreiben wir eine Proteom-Ansatz, um die Proteine, die mit der vollen Länge C-Terminus von P2X2-Rezeptoren interagieren zu identifizieren.
Protocol
Discussion
Ionenkanäle sind eine wichtige Klasse von integralen Membranproteinen. Sie enthalten Wasser gefüllten Poren, die selektiv erlauben die Bewegung der Ionen bis ihre elektrochemischen Gradienten über die Plasmamembran. Ionenkanäle Tor zwischen offenen und geschlossenen Zuständen. Die Gating Schritt wird durch Sender (z. B. ATP) im Falle von P2X-Liganden gesteuerte Ionenkanäle ausgelöst, oder es kann durch Wechselwirkungen mit anderen Proteinen reguliert werden. Das letzte Jahrzehnt hat eine Erhöhung der unser Verst…
Acknowledgements
SW und TMV werden durch die NCRR und NHLBI an den National Institutes of Health unterstützt. BSK und HS werden von der NINDS und NIGMS der National Institutes of Health unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Acetonitrile | Reagent | JT Baker | 9829-02 | |
| Acrylamide | Reagent | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Ampicillin | Reagent | VWR | VW1507-01 | |
| Ammonium Bicarbonate | Reagent | Fluka | 09830 | |
| Ammonium Persulphate (APS) | Reagent | Sigma | A3678 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) | Reagent | Sigma | A7699 | |
| Bradford reagent | Reagent | BIO-RAD | 500-0006 | |
| Bromophenol blue | Reagent | Fisher Scientific | B-392 | |
| Commassie blue R-250 | Reagent | Santa Cruz Biotechnology | Sc-24972 | |
| Dithiotritol (DTT) | Reagent | EMD | 3860 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Reagent | VWR | VW1474-01 | |
| Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma | E8145 | |
| Formic acid | Reagent | EMD | 11670-1 | |
| Glutathione Sepharose 4B beads | Reagent | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Reagent | Sigma | H1758 | |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Reagent | Sigma | 15502 | |
| Iodoacetamide | Reagent | Sigma | I1149 | |
| Luria-Bertani (LB) Media | Reagent | EMD | 1.00547.5007 | |
| Leupeptin | Reagent | Sigma | L8511 | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma | 62971 | |
| Magnesium Sulphate (MgSO4) | Reagent | Sigma | S7653 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Reagent | Sigma | S3014 | |
| Sodium Flouride (NaF) | Reagent | Sigma | S7920 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Reagent | Sigma | S6508 | |
| Nonidet P40 | Reagent | Fluka | 74385 | |
| Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) | Reagent | Sigma | P7626 | |
| Protease inhibitor tablet | Reagent | Sigma | S8820 | |
| Protein standard | Reagent | BIO-RAD | 161-0305 | |
| Sarkosyl | Reagent | Acros | 61207 | |
| Screw top vial | Tool | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Reagent | Sigma | L4509 | |
| SYPRO® Ruby protein gel stain | Reagent | BIO-RAD | 170-3125 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Reagent | Sigma | T9281 | |
| Tris base | Reagent | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma | T9284 | |
| Trypsin | Reagent | Promega | V5111 | |
| Tween 20 | Reagent | Sigma | P5927 | |
| Water | Reagent | Burdick&Jackson | 365-4 | |
| LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer | Tool | ThermoFisher Scientific | ||
| Nano Liquid Chromatography System | Tool | Eksigent | ||
| B-Mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M6250 | |
| Glycerol | EMD | GX0185-6 |
References
- Hille, B. . Ion channels of excitable membranes. , (2001).
- Khakh, B. S. Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses. Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).
- Egan, T. M., Khakh, B. S. Contribution of calcium ions to P2X channel responses. J Neurosci. 24, 3413-3420 (2004).
- Burnashev, N. Calcium permeability of ligand-gated channels. Cell Calcium. 24, 325-332 (1998).
- Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
- Levitan, I. B. Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels. Nat Neurosci. 9, 305-310 (2006).
- Khakh, B. S., North, R. A. P2X receptors as cell-surface ATP sensors in health and disease. Nature. 442, 527-532 (2006).
- Roger, S., Pelegrin, P., Surprenant, A. Facilitation of P2X7 receptor currents and membrane blebbing via constitutive and dynamic calmodulin binding. J Neurosci. 28, 6393-6401 (2008).
- North, R. A. Molecular physiology of P2X receptors. Physiol Rev. 82, 1013-1067 (2002).
- Khakh, B. S. International union of pharmacology. XXIV. Current status of the nomenclature and properties of P2X receptors and their subunits.. Pharmacol Rev. 53, 107-118 (2001).
- Young, M. T. Molecular shape, architecture and size of P2X4 receptors determined using fluorescence resonance energy transfer and electron microscopy. J Biol Chem. 283, 26241-26251 (2008).
- Edmondson, R. D. Protein kinase C epsilon signaling complexes include metabolism- and transcription/translation-related proteins: complimentary separation techniques with LC/MS/MS. Mol Cell Proteomics. 1, 421-433 (2002).
- Evans, R. J. Orthosteric and allosteric binding sites of P2X receptors. Eur Biophys J. 38, 319-327 (2009).
