Proteomica per identificare proteine che interagiscono con P2X2 Ligand-Gated canali di comunicazione
Summary
Descriviamo un semplice protocollo per identificare le proteine del cervello che si legano al capolinea pieno C lunghezza di ATP-dipendenti P2X2 recettori. L'estensione e l'applicazione sistematica di questo approccio a tutti i recettori P2X dovrebbe portare ad una migliore comprensione di segnalazione dei recettori P2X.
Abstract
Ligando-canali ionici alla base della comunicazione sinaptica nel sistema nervoso 1. Nei mammiferi ci sono tre famiglie di canali ligando-dipendenti: il ciclo Cys, il glutammato-dipendenti ed i canali recettori P2X 2. In ogni caso vincolante del trasmettitore porta alla apertura di un poro attraverso il quale gli ioni scendono i loro gradienti elettrochimici. Molti canali ligando-dipendenti sono permeabili agli ioni calcio 3, 4, che hanno ruoli di segnalazione a valle 5 (regolazione dei geni ad esempio) che possono superare la durata di apertura del canale. Così ligando-dipendenti canali in grado di segnalare su scale temporali di ampia portata da pochi millisecondi a giorni. Alla luce di questi importanti ruoli, è necessario capire come ligando-canali ionici si sono regolati da proteine, e come queste proteine possono regolare segnalazione. Studi recenti suggeriscono che molti, se non tutti, i canali possono far parte di complessi proteina di segnalazione 6. In questo articolo spiegheremo come identificare le proteine che si legano al C-terminale aspetti del settore P2X2 recettore citosolico.
Recettori P2X sono ATP-dipendenti canali di comunicazione e composto da sette subunità (P2X1-P2X7). Recettori P2X sono ampiamente espresse nel cervello, dove mediano la trasmissione sinaptica eccitatoria e facilitazione presinaptica di neurotrasmettitori versione 7. Recettori P2X si trovano nelle cellule eccitabili e non eccitabili e mediare ruoli chiave nella segnalazione neuronale, l'infiammazione e la funzione cardiovascolare 8. P2X2 recettori sono abbondanti nel sistema nervoso 9 e sono al centro di questo studio. Ogni subunità P2X è pensato di possedere due segmenti di membrana spanning (TM1 e TM2) separate da una regione extracellulare 7 e intracellulare N e C Termini (Fig. 1a) 7. Subunità P2X 10 (P2X1-P2X7) mostrano omologia di sequenza del 30-50% a livello di aminoacidi 11. Recettori P2X contengono solo tre subunità, che è il più semplice stechiometria tra recettori ionotropici. Il P2X2 C-terminale è composta da 120 aminoacidi (Fig. 1b) e contiene numerose proteine siti consenso docking, supportando l'ipotesi che P2X2 recettore può essere parte di complessi di segnalazione. Tuttavia, anche se diverse funzioni sono state attribuite al C-terminale del recettore P2X2 9 nessuno studio ha descritto i partner molecolari che paio al lato di questa proteina intracellulare attraverso tutta la lunghezza C-terminale. In questo documento si descrivono i metodi di un approccio di proteomica per identificare le proteine che interagiscono con l'intera lunghezza C-terminale del recettore P2X2.
Protocol
Discussion
Canali ionici sono una classe importante di proteine integrali di membrana. Essi contengono pori riempiti d'acqua che selettivamente permettono il movimento degli ioni i loro gradienti elettrochimici attraverso la membrana plasmatica. Ion cancello canali tra gli stati aperti e chiusi. Il passo gating è innescato da trasmettitori (es. ATP) in caso di P2X canali ionici ligando gated, o può essere regolata da interazioni con altre proteine. L'ultimo decennio ha visto un aumento della nostra comprensione di …
Acknowledgements
SW e TMV sono supportati dal NCRR e NHLBI presso il National Institutes of Health. BSK e HS sono supportati dal NINDS e NIGMS del National Institutes of Health.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Acetonitrile | Reagent | JT Baker | 9829-02 | |
| Acrylamide | Reagent | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Ampicillin | Reagent | VWR | VW1507-01 | |
| Ammonium Bicarbonate | Reagent | Fluka | 09830 | |
| Ammonium Persulphate (APS) | Reagent | Sigma | A3678 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) | Reagent | Sigma | A7699 | |
| Bradford reagent | Reagent | BIO-RAD | 500-0006 | |
| Bromophenol blue | Reagent | Fisher Scientific | B-392 | |
| Commassie blue R-250 | Reagent | Santa Cruz Biotechnology | Sc-24972 | |
| Dithiotritol (DTT) | Reagent | EMD | 3860 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Reagent | VWR | VW1474-01 | |
| Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma | E8145 | |
| Formic acid | Reagent | EMD | 11670-1 | |
| Glutathione Sepharose 4B beads | Reagent | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Reagent | Sigma | H1758 | |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Reagent | Sigma | 15502 | |
| Iodoacetamide | Reagent | Sigma | I1149 | |
| Luria-Bertani (LB) Media | Reagent | EMD | 1.00547.5007 | |
| Leupeptin | Reagent | Sigma | L8511 | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma | 62971 | |
| Magnesium Sulphate (MgSO4) | Reagent | Sigma | S7653 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Reagent | Sigma | S3014 | |
| Sodium Flouride (NaF) | Reagent | Sigma | S7920 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Reagent | Sigma | S6508 | |
| Nonidet P40 | Reagent | Fluka | 74385 | |
| Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) | Reagent | Sigma | P7626 | |
| Protease inhibitor tablet | Reagent | Sigma | S8820 | |
| Protein standard | Reagent | BIO-RAD | 161-0305 | |
| Sarkosyl | Reagent | Acros | 61207 | |
| Screw top vial | Tool | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Reagent | Sigma | L4509 | |
| SYPRO® Ruby protein gel stain | Reagent | BIO-RAD | 170-3125 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Reagent | Sigma | T9281 | |
| Tris base | Reagent | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma | T9284 | |
| Trypsin | Reagent | Promega | V5111 | |
| Tween 20 | Reagent | Sigma | P5927 | |
| Water | Reagent | Burdick&Jackson | 365-4 | |
| LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer | Tool | ThermoFisher Scientific | ||
| Nano Liquid Chromatography System | Tool | Eksigent | ||
| B-Mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M6250 | |
| Glycerol | EMD | GX0185-6 |
References
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