P2X2リガンド依存性陽イオンチャネルと相互作用するタンパク質を特定するためのプロテオミクス
Summary
我々は、ATP依存性P2X2受容体の全長のC末端に結合する脳の蛋白質を識別するための単純なプロトコルを記述する。すべてのP2X受容体へのこのアプローチの拡張と体系的なアプリケーションは、P2X受容体シグナル伝達の理解につながることが期待される。
Abstract
リガンド依存性イオンチャネルは神経系1でシナプスのコミュニケーションを貫く。システインループ、グルタミン酸ゲートおよびP2X受容体チャネル2：哺乳類ではリガンド依存性チャネルの3つのファミリがあります。それぞれの場合に送信機の結合はイオンが電気化学的勾配を流れに経由する細孔の開口部につながる。多くのリガンド依存性チャネルは、またダウンストリームチャネルの開口部の持続時間を超える可能性の役割5（例えば、遺伝子の調節）をシグナリングしているカルシウムイオン3、4、に透過性である。したがって、リガンド依存性チャネルは、数ミリ秒から数日までの幅広い時間スケールで信号を送ることができる。これらの重要な役割を考えるとそれはそれ自体がタンパク質、そしてどのようにこれらのタンパク質は、シグナル伝達に調整できることで規制されている方法リガンド依存性イオンチャネルを理解する必要があります。最近の研究では、多くが、すべてではありませんが、チャンネルは蛋白質シグナル伝達複合体6の一部である可能性を示唆している。この記事では、P2X2受容体細胞質ドメインのC末端の側面に結合するタンパク質を同定する方法を説明します。
P2X受容体はATP依存性陽イオンチャネルであり、7つのサブユニット（P2X1 – P2X7）で構成されています。 P2X受容体は広く彼らは興奮性シナプス伝達や神経伝達物質放出7のシナプス前促通を媒介する脳、で表されます。 P2X受容体は興奮性および非興奮性細胞に存在し、神経細胞シグナリング、炎症と心血管機能8で重要な役割を仲介している。 P2X2受容体は神経系9に豊富であり、この研究の焦点です。各P2Xサブユニットは細胞外領域7と細胞内のNおよびC末端（図1a）7によって分離された二つの膜貫通セグメント（TM1＆TM2）を持つと考えられている。 P2Xサブユニット10は、（P2X1 – P2X7）アミノ酸レベル11で30〜50％の配列相同性を示す。 P2X受容体はイオンチャネル型受容体の中で最も単純な化学量論であるのみ3つのサブユニットが含まれています。 P2X2のC -末端は120アミノ酸（図1b）を構成され、P2X2受容体のシグナル伝達複合体の一部である可能性があるという仮説を支持する、いくつかのタンパク質のドッキングのコンセンサス部位が含まれています。いくつかの機能がP2X2受容体9のない研究のC -末端に起因しているが、しかし、全長C末端を介して、このタンパク質の細胞内側に結合する分子のパートナーを説明しました。この方法を本稿では、P2X2受容体の全長C末端と相互作用するタンパク質を同定するプロテオミクスアプローチを説明します。
Protocol
Discussion
イオンチャネルは、膜内在性タンパク質の主要なクラスです。彼らは選択的に形質膜を横断し、その電気化学的勾配下にイオンの移動を可能にする水の満たされた気孔が含まれています。開いた状態および閉じた状態との間のイオンチャネルのゲート。ゲーティングのステップは、P2Xリガンド依存性イオンチャネルの場合の送信機（例：ATP）によって引き起こされる、またはそれが他のタン?…
Acknowledgements
SWとTMVは、国立衛生研究所のNCRRとNHLBIでサポートされています。 BSKとHSは、国立衛生研究所のNINDSとNIGMSでサポートされています。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Acetonitrile | Reagent | JT Baker | 9829-02 | |
| Acrylamide | Reagent | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Ampicillin | Reagent | VWR | VW1507-01 | |
| Ammonium Bicarbonate | Reagent | Fluka | 09830 | |
| Ammonium Persulphate (APS) | Reagent | Sigma | A3678 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) | Reagent | Sigma | A7699 | |
| Bradford reagent | Reagent | BIO-RAD | 500-0006 | |
| Bromophenol blue | Reagent | Fisher Scientific | B-392 | |
| Commassie blue R-250 | Reagent | Santa Cruz Biotechnology | Sc-24972 | |
| Dithiotritol (DTT) | Reagent | EMD | 3860 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Reagent | VWR | VW1474-01 | |
| Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma | E8145 | |
| Formic acid | Reagent | EMD | 11670-1 | |
| Glutathione Sepharose 4B beads | Reagent | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Reagent | Sigma | H1758 | |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Reagent | Sigma | 15502 | |
| Iodoacetamide | Reagent | Sigma | I1149 | |
| Luria-Bertani (LB) Media | Reagent | EMD | 1.00547.5007 | |
| Leupeptin | Reagent | Sigma | L8511 | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma | 62971 | |
| Magnesium Sulphate (MgSO4) | Reagent | Sigma | S7653 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Reagent | Sigma | S3014 | |
| Sodium Flouride (NaF) | Reagent | Sigma | S7920 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Reagent | Sigma | S6508 | |
| Nonidet P40 | Reagent | Fluka | 74385 | |
| Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) | Reagent | Sigma | P7626 | |
| Protease inhibitor tablet | Reagent | Sigma | S8820 | |
| Protein standard | Reagent | BIO-RAD | 161-0305 | |
| Sarkosyl | Reagent | Acros | 61207 | |
| Screw top vial | Tool | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Reagent | Sigma | L4509 | |
| SYPRO® Ruby protein gel stain | Reagent | BIO-RAD | 170-3125 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Reagent | Sigma | T9281 | |
| Tris base | Reagent | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma | T9284 | |
| Trypsin | Reagent | Promega | V5111 | |
| Tween 20 | Reagent | Sigma | P5927 | |
| Water | Reagent | Burdick&Jackson | 365-4 | |
| LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer | Tool | ThermoFisher Scientific | ||
| Nano Liquid Chromatography System | Tool | Eksigent | ||
| B-Mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M6250 | |
| Glycerol | EMD | GX0185-6 |
References
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