गैर रेडियोधर्मी बगल में संकरण नॉर्वे Spruce के लिए लागू प्रोटोकॉल और संयंत्र प्रजाति की एक रेंज

Summary

हम एक संशोधित डीआईजी वर्णन<em> बगल में</em> संकरण प्रोटोकॉल, जो तेजी से और नॉर्वे सजाना सहित संयंत्र प्रजातियों में से एक विस्तृत रेंज पर लागू है. बस बदल RNase उपचार और proteinase कश्मीर एकाग्रता सहित कुछ समायोजन के साथ, प्रोटोकॉल और विभिन्न ऊतकों और प्रजातियों के अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

The high-throughput expression analysis technologies available today give scientists an overflow of expression profiles but their resolution in terms of tissue specific expression is limited because of problems in dissecting individual tissues. Expression data needs to be confirmed and complemented with expression patterns using e.g. in situ hybridization, a technique used to localize cell specific mRNA expression. The in situ hybridization method is laborious, time-consuming and often requires extensive optimization depending on species and tissue. In situ experiments are relatively more difficult to perform in woody species such as the conifer Norway spruce (Picea abies). Here we present a modified DIG in situ hybridization protocol, which is fast and applicable on a wide range of plant species including P. abies. With just a few adjustments, including altered RNase treatment and proteinase K concentration, we could use the protocol to study tissue specific expression of homologous genes in male reproductive organs of one gymnosperm and two angiosperm species; P. abies, Arabidopsis thaliana and Brassica napus. The protocol worked equally well for the species and genes studied. AtAP3 and BnAP3 were observed in second and third whorl floral organs in A. thaliana and B. napus and DAL13 in microsporophylls of male cones from P. abies. For P. abies the proteinase K concentration, used to permeablize the tissues, had to be increased to 3 g/ml instead of 1 g/ml, possibly due to more compact tissues and higher levels of phenolics and polysaccharides. For all species the RNase treatment was removed due to reduced signal strength without a corresponding increase in specificity. By comparing tissue specific expression patterns of homologous genes from both flowering plants and a coniferous tree we demonstrate that the DIG in situ protocol presented here, with only minute adjustments, can be applied to a wide range of plant species. Hence, the protocol avoids both extensive species specific optimization and the laborious use of radioactively labeled probes in favor of DIG labeled probes. We have chosen to illustrate the technically demanding steps of the protocol in our film.

Anna Karlgren and Jenny Carlsson contributed equally to this study.

Corresponding authors: Anna Karlgren at Anna.Karlgren@ebc.uu.se and Jens F. Sundström at Jens.Sundstrom@vbsg.slu.se

Protocol

स्वस्थानी संकरण प्रोटोकॉल में यह गैर रेडियोधर्मी mRNA नॉर्वे सजाना ऊतकों के लिए अनुकूलित है और विस्तार में वर्णित है . यह Arabidopsis / स्वस्थानी संकरण हमारे समूहों, जो बारी में Meyerowitz और आयरिश प्रयोगशालाओं से प्रोटोकॉल पर आधारित है और 1-4 दूसरों के बीच में विवियन आयरिश, सिंडी लिंकन और जेफ लांग द्वारा अनुकूलित अनुकूलित प्रोटोकॉल में रेपसीड पर आधारित है. प्रक्रिया 1. निर्धारण और एम्बेडिंग शाही सेना प्रतिधारण ऊतकों प्रदान करने के लिए उतारना चाहते हो और मोम में एम्बेडेड पहले सीटू प्रयोग में किया जाता है की जरूरत है. निर्धारण और एम्बेडिंग एक महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि खराब तय सामग्री भले ही mRNA अत्यधिक प्रचुर मात्रा में है एक कम या undetectable संकेत दे सकता है. ऊतकों निर्जलित रहे हैं, मंजूरी दे दी है और ऊतकों को नुकसान से बचने के क्रमिक परिवर्तन में मोम में एम्बेडेड है. आगे संकोचन और 0.85% NaCl नॉर्वे सजाना ऊतकों के निर्जलीकरण में पहली इथेनॉल चरणों में जोड़ा जाता है कोशिकाओं की सूजन से बचने के. यह संभव है इथेनॉल में NaCl (उदाहरण के लिए यह प्रोटोकॉल / Arabidopsis रेपसीड में छोड़ दिया है) के लिए बाहर छोड़. embedding के दौरान निर्जलीकरण कदम बर्फ पर प्रदर्शन किया जा सकता है या कम से कम चार डिग्री सेल्सियस RNase गतिविधि रखने इस प्रोटोकॉल में 4% paraformaldehyde तय समाधान 0.25% glutaraldehyde, जो एक बेहतर आरएनए प्रतिधारण भले ही है कि कुछ का तर्क है कि यह शायद कोई अंतर नहीं है (उदाहरण के लिए यह प्रोटोकॉल / Arabidopsis रेपसीड में छोड़ दिया है) बनाता है देने के लिए माना जाता है शामिल हैं. सबसे अधिक संभावना किसी भी मानक निर्धारण और एम्बेडिंग प्रोटोकॉल इस्तेमाल किया जा सकता है. नॉर्वे सजाना एम्बेडिंग नीचे देखा प्रोटोकॉल / Arabidopsis रेपसीड से थोड़ा अलग है. 1.1 दिवस 1 एकत्रित संयंत्र सामग्री और paraformaldehyde नियतन ब्याज की संयंत्र सामग्री ले लीजिए और यदि आवश्यक हो तो काटना. बर्फ पर ऊतकों रखें और उन्हें ठंडा तय समाधान में जगह (नीचे व्यंजनों देखें) संभव नो बॉल सीधे या जितनी जल्दी हो.! बर्फ पर हर समय रखो! नमूने निर्वात लागू जब तक paraformaldehyde बुलबुला शुरू होता है. तीन घंटे (जैसे 2 x Arabidopsis और रेपसीड पुष्प ऊतकों या नॉर्वे सजाना पुरुष शंकु के लिए एक घंटे के लिए 15 मिनट) के लिए वैक्यूम पकड़ो और वैक्यूम धीरे रिलीज. ऊतकों को लगानेवाला के निर्वात घुसपैठ के बाद सिंक करने की अपेक्षा की जाती है, लेकिन हवा का एक बहुत से युक्त कुछ ऊतकों के लिए यह संभव नहीं है (उदाहरण के Arabidopsis फूल). धुंध का एक टुकड़ा ऊतकों लगानेवाला में रहने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. लगानेवाला और 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात (~ 12-16 घंटे) धीरे मिलाते सेते बदलें. विकल्प 1 नो बॉल! नॉर्वे सजाना एम्बेडिंग नीचे संस्करण (चरणों 4-8). यकीन है कि जगमगाहट ट्यूब या कांच की शीशियों, चरण 5 में कम से कम उपयोग किया जाता है . 1.2 दिन 2 निर्जलीकरण एनबी! नॉर्वे सजाना एम्बेडिंग संस्करण. 0.85% NaCl 30 मिनट बर्फ़ में. 50% EtOH + 0.85% NaCl 90 मिनट बर्फ़ में. 70% EtOH + 0.85% NaCl 90 मिनट बर्फ़ में. रोकें! यह संभव है करने के लिए यहाँ बंद करो और डिग्री सेल्सियस कई महीनों के लिए 4 में 70% EtOH + 0.85% NaCl में ऊतकों की दुकान है. 85% EtOH + 0.85% NaCl 90 मिनट 4 ° C 95% EtOH (eosin +) 90 मिनट 4 ° C नो बॉल! Eosin उन्हें एम्बेड और सेक्शनिंग के दौरान पता लगाने के लिए आसान बनाने के गुलाबी ऊतकों दाग जोड़ा है लेकिन इसे बाहर रखा जा सकता है. 100% EtOH (eosin +) 90 मिनट 4 ° C 100% EtOH (eosin +) रात भर 4 ° C 1.3 दिन 3 निर्जलीकरण और नो बॉल एम्बेडिंग! नॉर्वे सजाना एम्बेडिंग संस्करण. <ol sतीखा = "5"> 100% EtOH (eosin +) 2 घंटे कमरे के तापमान 50% EtOH + 50% Histoclear द्वितीय 1 घंटे कमरे के तापमान 100% Histoclear द्वितीय 1 घंटे कमरे के तापमान 100% Histoclear द्वितीय 1 घंटे कमरे के तापमान 50% Histoclear + 50% Histowax II रात भर 40-50 ° C नो बॉल! अंतिम चरण में Histowax की एकाग्रता नहीं है महत्वपूर्ण है, बस कुछ मोम चिप्स में डाल देना . 1.4 दिवस 4 एम्बेडिंग एनबी! नॉर्वे सजाना एम्बेडिंग संस्करण. 100% पिघला Histowax 60 ° C (बदले सुबह और शाम) 1.5 5 दिन एम्बेडिंग एनबी! नॉर्वे सजाना एम्बेडिंग संस्करण. 100% पिघला Histowax 60 ° C (बदले सुबह और शाम) 1.6 दिन 6 एम्बेडिंग एनबी! नॉर्वे सजाना एम्बेडिंग संस्करण. 100% पिघला Histowax 60 ° C (बदले सुबह और शाम) नो बॉल! यह ठीक है अगर मोम कभी कभी एक दिन में एक बार बदल जाता है, लेकिन तो यह दो दिन लगते हैं परिवर्तन का एक दिन पूरा हैं. मोम परिवर्तन भी एक समस्या के बिना दो अतिरिक्त दिन के लिए जारी रख सकते हैं . यह बड़े नमूनों के लिए सिफारिश की है क्योंकि यह इन ऊतकों के केंद्र में मोम की घुसपैठ में मदद करता है. विकल्प 2 नो बॉल! Arabidopsis / रेपसीड एम्बेडिंग नीचे संस्करण (चरणों 4-8). 1.2 दिन 2 निर्जलीकरण एनबी! Arabidopsis / रेपसीड एम्बेडिंग संस्करण. नो बॉल! 4 पर सभी चरणों डिग्री सेल्सियस और धीरे से मिलाते हुए, कहा नहीं है और अगर. 1x पीबीएस 30 मिनट 1x पीबीएस 30 मिनट 30% EtOH 60 मिनट 40% EtOH 60 मिनट 50% EtOH 60 मिनट 60% EtOH 60 मिनट 70% EtOH 60 मिनट रोकें! यह संभव है करने के लिए यहाँ बंद करो और डिग्री सेल्सियस कई महीनों के लिए 4 में 70% EtOH में ऊतकों की दुकान है. 85% EtOH 60 मिनट 95% EtOH (eosin +) रात भर नो बॉल! Eosin उन्हें एम्बेड और सेक्शनिंग के दौरान पता लगाने के लिए आसान बनाने के गुलाबी ऊतकों दाग जोड़ा है लेकिन इसे बाहर रखा जा सकता है. 1.3 दिन 3 निर्जलीकरण और embeddआईएनजी एनबी! Arabidopsis / रेपसीड एम्बेडिंग संस्करण. नो बॉल! कमरे के तापमान पर सभी कदम है और धीरे मिलाते हुए, अगर कुछ नहीं कहा गया है. 100% EtOH (eosin +) 30 मिनट 100% EtOH (eosin +) 30 मिनट 100% EtOH (eosin +) 60 मिनट 100% EtOH (eosin +) 60 मिनट नो बॉल! ऊतक जगमगाहट शीशियों या अन्य शीशियों (कांच) के लिए स्थानांतरण . 75% EtOH + 25% Histoclear द्वितीय 30 मिनट 50% EtOH + 50% Histoclear द्वितीय 30 मिनट 25% EtOH + 75% Histoclear द्वितीय 30 मिनट 100% Histoclear द्वितीय 60 मिनट 100% Histoclear द्वितीय 60 मिनट 100% Histoclear + मात्रा ¼ Histowax चिप II रातोंरात (मिलाते हुए नहीं) नो बॉल! अंतिम चरण में Histowax की एकाग्रता नहीं है महत्वपूर्ण है, बस कुछ मोम चिप्स में डाल देना . 1.4 दिवस 4 एम्बेडिंग एनबी! Arabidopsis / रेपसीड एम्बेडिंग संस्करण. ऊतकों के साथ शीशियों 42 डिग्री सेल्सियस जब तक मोम चिप्स पूरी तरह से पिघल प्लेस. अगला ¼ मोम चिप्स की मात्रा को जोड़ने और उन्हें पूरी तरह से पिघल. 60 के लिए जाना डिग्री सेल्सियस और कई घंटे के लिए शीशियों छोड़ दें. अंत में, 60 में ताजा पिघला मोम और रात खत्म सेते डिग्री सेल्सियस के साथ Histoclear / द्वितीय मोम की जगह 1.5 5 दिन एम्बेडिंग एनबी! Arabidopsis / रेपसीड एम्बेडिंग संस्करण. 100% पिघला Histowax 60 ° C (बदले सुबह और शाम) 1.6 दिन 6 एम्बेडिंग एनबी! Arabidopsis / रेपसीड एम्बेडिंग संस्करण. 100% पिघला Histowax 60 ° C (बदले सुबह और शाम) नो बॉल! प्रोटोकॉल / Arabidopsis रेपसीड (नॉर्वे सजाना प्रोटोकॉल की तुलना में) के रूप में 5-6 दिन में एक 7 दिन एक ही रास्ते में एम्बेड है, यानी 100% 60 में पिघल Histowax डिग्री सेल्सियस और सुबह और शाम में परिवर्तन नो बॉल! यह ठीक है अगर मोम कभी कभी एक दिन में एक बार बदल जाता है, लेकिन तो यह दो दिन लगते हैं परिवर्तन का एक दिन पूरा हैं. मोम परिवर्तन भी एक समस्या के बिना दो अतिरिक्त दिन के लिए जारी रख सकते हैं . यह बड़े नमूनों के लिए सिफारिश की है क्योंकि यह इन ऊतकों के केंद्र में मोम की घुसपैठ में मदद करता है. 1.7 दिन 7 एम्बेडिंग (प्रोटोकॉल / Arabidopsis रेपसीड दिवस 8) (Film! तकनीकी विवरण फिल्म में दिखाया जाता है ) पहले से गरम पेट्री डिश और / या 60 पर molds के डिग्री सेल्सियस एक गर्म थाली पर मुड़ें (60 डिग्री सेल्सियस) और सुनिश्चित करें कि पिघला Histowax उपलब्ध है. एक पेट्री डिश (या एक साँचे में ढालना) गर्म थाली पर रखा में ऊतकों और पिघला Histowax डालो. अधिक Histowax ताकि ऊतकों को कवर कर रहे हैं जोड़ें. हीट चिमटी की एक जोड़ी और ऊतकों डिश में समान रूप से वितरित. पेट्री डिश (या मोल्ड) भरें. यदि मोम hardens के पहले ऊतकों को सही स्थिति में हैं, यह गर्मी फिर या चिमटी के गर्म जोड़ी के साथ कठोर मोम हटाने. कमरे के तापमान पर मोम ब्लॉक कठोर यह 4 पर रखने से पहले ° सी. चलो यह ऊतकों बहुत कसकर एम्बेड के बाद से मोम ब्लॉक दरार हो सकता है जब टुकड़े सेक्शनिंग के दौरान बाहर काट रहे हैं के बजाय कई मोम ब्लॉक करना बेहतर है. रोकें! चार और स्टोरडिग्री; सी. ऊतकों साल के लिए स्थिर कर रहे हैं. नो बॉल! इस कदम और उसके बाद से RNase मुक्त कार्य. दस्ताने का उपयोग करें, MilliQ – पानी, buffers, कांच के बने पदार्थ आदि, आटोक्लेव buffers और सेंकना कांच के बने पदार्थ जब उचित आदि DEPC इलाज. 2. सेक्शनिंग (Film! तकनीकी विवरण फिल्म में दिखाया गया है) दो गर्म प्लेटों पर मुड़ें (60 डिग्री सेल्सियस और 42 डिग्री सेल्सियस) और सुनिश्चित करें कि पिघला Histowax उपलब्ध है. एक स्केलपेल गर्मी और ध्यान से बाहर पेट्री डिश (यह दरार हो सकता है अगर एक भी हिंसक है) से ऊतक के एक मोम ब्लॉक में कटौती, या यह मोल्ड से हटा. जब एक एकल मोम ब्लॉक अलग किया गया है, सही आकार और आकार में टुकड़े आकार सूक्ष्म तक्षणी में टुकड़ा करने की क्रिया की सुविधा. मोम टुकड़ा ऊतक के नीचे एक अतिरिक्त मोम "एड़ी" तो यह ब्लॉक धारक के लिए संलग्न किया जा सकता है चाहिए. गर्म थाली (60 डिग्री सेल्सियस) पर ब्लॉक धारक और एड़ी गर्मी और उन्हें एक साथ फ्यूज. यह Histowax द्वितीय की एक बूंद संलयन को स्थिर बनाने पर डाल करने के लिए आवश्यक हो सकता है. यह 4 पर चलो कठोर डिग्री सेल्सियस मोम ब्लॉक 6-8 सुक्ष्ममापी मोटी एक लंबी रिबन में एक सूक्ष्म तक्षणी का उपयोग कर जुड़ा वर्गों में काटें. नो बॉल! यह आसान हो सकता है अगर मोम ब्लॉक ठंड, यानी दुकान चार पर मोम ब्लॉक डिग्री सेल्सियस और इसे फ्रिज में से लाने के लिए जब काटने शुरू. यह भी फायदेमंद हो सकता है चाकू ठंडा रख सकते हैं. अध्ययन एक आवर्धक कांच में वर्गों के रिबन और लोगों के लिए इस्तेमाल किया जा निशान. स्लाइड्स पर RNase मुक्त MilliQ पानी रखो (जांच में प्लस फिशर जैव प्रौद्योगिकी, जो पूर्व में साफ कर रहे हैं और चार्ज से). छोटे टुकड़ों में रिबन कट और उन्हें स्लाइड पर डाल ("वापस" या "चमकदार" नीचे की ओर). रिबन के साथ स्लाइड्स 42 ° सी प्लेट पर रखा जाना चाहिए. रिबन पानी में (यह महत्वपूर्ण है!) समतल चाहिए. वर्गों के कुछ मिनट के लिए बैठते हैं और फिर एक कागज / Kimwipe ऊतक का उपयोग करने के लिए पानी की नाली चलो. 1-2 घंटे के लिए थाली पर स्लाइड्स छोड़ो. 42 में स्लाइड्स सेते ° सी रातोंरात इतना है कि ऊतकों स्लाइड्स का पालन. रोकें! यह वर्गों को जितनी जल्दी हो सके उपयोग की सिफारिश की है, लेकिन वे बंद बक्से में शुष्क कर सकते हैं चार में कई दिनों के लिए desiccant ° सी. के साथ संग्रहीत 3. जांच के निर्माण स्वस्थानी संकरण में अभिव्यक्ति का उपयोग कर एक निश्चित mRNA के लिए लेबल जांच विशिष्ट पता लगाता है. जांच, जो सबसे अक्सर पूरक शाही सेना का एक टुकड़ा है digoxigenin, डीआईजी के साथ टैग किया जा सकता है. डीआईजी एक छोटे अणु है, जो uridine के लिए संलग्न किया जा सकता है और जिससे शाही सेना जांच में शामिल किया और फिर पता चला डीआईजी-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग है. डिजाइन और जांच के प्रयोग स्वस्थानी संकरण में एक शाही सेना में सबसे महत्वपूर्ण कदम है. देखभाल करने के लिए यकीन है कि जांच एक उच्च विशिष्टता है और उच्च गुणवत्ता UTPs के साथ लेबल बनाने के लिए लिया जाना चाहिए. कभी कभी संकरण तापमान और / या प्रतिक्रिया लंबाई विशिष्ट जांच के लिए समायोजित किया जाना है. हमेशा की तरह, देखभाल RNase संक्रमण से बचने के लिए लिया जाना चाहिए. लेबलिंग से पहले, एक अपने मानक प्रोटोकॉल के अनुसार टेम्पलेट को अलग करने के लिए, जैसे सीडीएनए क्लोन, पीसीआर – टुकड़े का उपयोग करें और टेम्पलेट linearize. नब्ज और antisense टुकड़े अलग कर रहे हैं और जीन विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग कर टेम्पलेट से परिलक्षित. के लिए पीसीआर प्रवर्धित टुकड़े एंजाइमों कि 3 overhangs उत्पादन का उपयोग नहीं करते. सभी टुकड़ों के लिए एक T7 (या SP6 या T3) की अधिकता T7 अनुक्रम ले प्राइमरों का उपयोग या एक T7 प्रमोटर के साथ एक सदिश का उपयोग करने के लिए जोड़ा जाता है. भावना (mRNA या (-) भूग्रस्त) जांच लक्ष्य mRNA के रूप में एक ही अनुक्रम है और लक्ष्य mRNA संकरण नहीं होगा, जबकि antisense (विरोधी mRNA या (+) कतरा) जांच पूरक अनुक्रम है और इस तरह से संकरण हित के संकेत दे रही है लक्ष्य. भावना जांच एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है और कोई संकेत अगर प्रयोग ठीक से काम प्राप्त किया जाएगा. एक सकारात्मक नियंत्रण भी जरूरत है, उदाहरण के लिए एक जांच है कि एक घर रखने के जीन का पता लगाता है. स्लाइड्स की बहुमत antisense जांच के साथ संकरित किया जाना चाहिए, जबकि केवल कुछ स्लाइड्स को अलग नियंत्रण जांच करने के लिए संकरित किया जाना चाहिए. इन विट्रो प्रतिलेखन में 3.1 जांच का उपयोग लेबलिंग डीआईजी आरएनए लेबल किट (SP6/T7, 11175025910, Roche एप्लाइड साइंस, मैनहेम, जर्मनी) से अभिकर्मकों या इसी तरह जब जांच लेबलिंग किया जाता है. 20 μl प्रतिक्रिया यहाँ वर्णित ~ डीआईजी लेबल शाही सेना के 10 μg उपज चाहिए. एक में इन विट्रो प्रतिलेखन लेबल nucleotides शामिल करें. एक ट्यूब (बर्फ पर रखने) निम्नलिखित अभिकर्मकों जोड़ें: घटक मात्रा राशि / X 10 एनटीपी लेबलिंग मिश्रण 2 μl 10 एक्स ट्रांसक्रिप्शन बफर 2 μl रक्षा RNase अवरोध करनेवाला 1 μl (20U) शाही सेना T7 पोलीमरेज़ (SP6 या T3) 2 μl टेम्पलेट डीएनए (500-1000 एनजी) एक्स μl RNase मुक्त MilliQ – पानी y 18 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए μl, एनटीपी लेबलिंग मिश्रण, प्रतिलेखन बफर, RNase अवरोध करनेवाला मिक्स (NB! अगर जांच कम है, जैसे <500bp, आप 40U के लिए RNase अवरोध करनेवाला एकाग्रता में वृद्धि हो सकती है), पोलीमरेज़, टेम्पलेट डीएनए और पानी और तब संक्षिप्त अपकेंद्रित्र. 37 पर प्रतिक्रिया मिश्रण सेते ° 2 घंटे के लिए सी (NB! अगर जांच कम है, जैसे <500bp, 4-6 घंटे के लिए प्रतिक्रिया समय को बढ़ाने के लिए). 15 मिनट के लिए 2 μl DNase और मैं सेते 37 ° C जोड़ें. 2 μl 0.2 एम EDTA (8.0 पीएच) जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो. जेल पर उत्पाद की जाँच करें. 4 एम LiCl और> 99.5% इथेनॉल के 75 μl 2.5 μl जोड़कर जांच वेग. अच्छी तरह मिक्स और -20 पर सेते डिग्री सेल्सियस रातोंरात (NB! tRNA वाहक के रूप में उपयोग नहीं क्या इसके बजाय glycogen या acrylamide निर्माताओं के लिए अनुसार उपयोग ). 4 में 30 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र (000 rpm 13) ° सी और सतह पर तैरनेवाला हटायें. (कम से कम 10 मिनट 000 13 rpm) 70% इथेनॉल में गोली दो बार (~ 150-300 μl) धो लें. सतह पर तैरनेवाला निकालें और गोली सूख जाने. 30 μl RNase मुक्त पानी में बर्फ पर 1-2 घंटे के लिए जांच Resuspend. रोकें! जांच एक साल से भी अधिक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है. नो बॉल! कदम 21 (इन विट्रो प्रतिलेखन में पहले), कदम 23 (DNase उपचार से पहले), 24 कदम से (DNase उपचार के बाद, लेकिन तेज़ी से पहले) 0.5 μl नमूने सहेजें और 27 कदम (जब जांच किया गया है 1 μl नमूना ) resuspended. Nondenaturating 1% TBE जेल पर नमूने चलाएँ. यदि DNase प्रतिक्रिया काम किया है ठीक टेम्पलेट बैंड गायब हो जाएगा. में इन विट्रो प्रतिलेखन लगभग सही आकार की एक मोटी शाही सेना बैंड उत्पन्न करनी चाहिए. यदि आप एकाधिक बैंड देखने के लिए, 80 ° सी में 5 मिनट के लिए लोड करने से पहले बर्फ पर शमन के बाद नमूने denaturate. यदि 27 कदम से वसूली बुरा लग रहा है यह तो हो सकता है क्योंकि अच्छी तरह से जांच नहीं resuspended था हो सकता है. 55 में शाही सेना सेते डिग्री सेल्सियस 5-10 मिनट के समाधान में पाने के लिए . लंबी जांच के 3.2 hydrolysis नो बॉल! यदि आपके जांच 150 बीपी से बड़ा है यह 50-150 बीपी कम किया जाना चाहिए एक उच्च संकेत, बेहतर प्रवेश के लिए कारण दे. जांच रासायनिक कार्बोनेट बफर (10.2 पीएच) में अपमानित किया जा सकता है . यदि जांच hydrolysis कदम को छोड़ सही आकार की है, लेकिन जांच करने के लिए एक मात्रा formamide, यानी 30 μl, जोड़ने के लिए याद है. 0.2 एम सोडियम बिकारबोनिट (3 NaHCO) और 0.2 एम सोडियम कार्बोनेट (ना 2 3 CO) तैयार है . दोनों ताजा होना चाहिए. टेस्ट मिश्रण 5 मिलीलीटर एच 2 हे, 2 मिलीलीटर 0.2 एम 3 NaHCO और 3 मिलीलीटर 0.2 एम ना 2 3 सीओ द्वारा दो बफ़र्स. पीएच 10.2 ~ होना चाहिए. ऊष्मायन समय की गणना: ऊष्मायन समय (मिनट में) = (एल 0 एल च) / (कश्मीर * एल 0 * च एल) एल = 0 केबी में जांच के शुरू लंबाई एल च = केबी में जांच के अंतिम लंबाई = जैसे .100 केबी कश्मीर = दर = 0.11 केबी 1min-1 hydrolysis के लिए निरंतर अपनी जांच के आधे Hydrolyze, बाद के लिए बाकी बचा. RNase मुफ्त पानी के साथ 50 μl जांच पतला और 20 μl 0.2 एम 3 NaHCO (पहली जोड़) और 30 μl 0.2 एम ना 2 3 सीओ जोड़ें. मिश्रण और गणना ऊष्मायन समय के लिए 60 ° सी में सेते हैं. 1 एम NaOAc पीएच 4.7 10 μl जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो. 10 μl 4 एम 2 LiCl और 300 μl ethano जोड़कर जांच वेगएल (NB! ग्लाइकोजन का प्रयोग करें या वाहक के रूप में acrylamide, अगर जरूरत). -20 ° रातोंरात सी सेते हैं. 4 में 30 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र (000 rpm 13) ° सी और सतह पर तैरनेवाला हटायें. 70% इथेनॉल (~ 300 μl) में गोली दो बार धोएं. अपकेंद्रित्र (13 000 rpm) 4 में प्रत्येक धोने में कम से कम 10 मिनट डिग्री सेल्सियस सतह पर तैरनेवाला निकालें और गोली सूख जाने. 30 μl RNase मुक्त MilliQ पानी में जांच Resuspend. जांच के लिए एक मात्रा formamide, यानी 30 μl जोड़ें. रोकें! जांच एक साल से भी अधिक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है. नो बॉल! Unhydrolyzed जांच के 2 μl और hydrolyzed जांच के 2 μl (पहले formamide जोड़ा जाता है) ले लो और एक nondenaturating 1% TBE जेल पर जांच . वहाँ दो नमूने के बीच आकार में एक फर्क होना चाहिए . जांच करने के लिए 80 ° C पर 5 मिनट के लिए लोड करने से पहले बर्फ पर शमन के बाद denaturated की आवश्यकता हो सकती है. 4. स्वस्थानी संकरण में (Film! तकनीकी विवरण फिल्म में दिखाया जाता है ) सुनिश्चित करें कि सभी समाधान RNase मुक्त हैं! यह DEPC – सब कुछ का इलाज करने के लिए आवश्यक नहीं है, लेकिन कम से कम autoclaved MilliQ पानी का उपयोग. सुनिश्चित करें कि सभी कांच के बने पदार्थ 200 गरम कर रहे हैं डिग्री सेल्सियस रातोंरात या कम से कम 5 घंटे के लिए. प्लास्टिक के कंटेनर समझो और आंदोलन के साथ 0.1 एम NaOH के साथ सलाखों के रात हलचल. प्लास्टिक के कंटेनर autoclaved MilliQ – पानी (~ 500 मिलीग्राम / कंटेनर) के साथ कई बार कुल्ला करें. यह कंटेनरों ध्यान से कुल्ला NaOH के निशान है कि संकरण परेशान हो सकता है से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. DEPC इलाज Tris – बफ़र्स को छोड़कर सभी शेयर समाधान. करने के लिए सुनिश्चित करें कि सब कुछ उपलब्ध है है प्रयोग शुरू करने से पहले सभी समाधान आदि की जाँच करें. 61 कदम (51-52 चरणों को छोड़कर) तक हम एक रैक, जो आसानी से कंटेनरों के बीच ले जाया जाता है में स्लाइड्स रखना. 4.1 सीटू अनुभाग pretreatment में वर्गों Deparaffinize / निर्जलीकरण: 2x 10 मिनट Histoclear द्वितीय (ग्लास कंटेनर का उपयोग करें) 1-2 2x मिनट EtOH 100% 1-2 मिनट 95% EtOH 1-2 मिनट 90% EtOH 1-2 मिनट 80% EtOH 1-2 मिनट 60% EtOH 1-2 मिनट 30% EtOH 1-2 मिनट एच 2 हे कमरे Temp (NB! ऊष्मायन समय के दौरान 42 कदम में इस्तेमाल किया paraformaldehyde तैयार) 2x एसएससी में 15-20 मिनट के लिए स्लाइड्स को धो लें. 37 में proteinase कश्मीर के साथ 30 मिनट के लिए ऊतकों दावत ° सी कोमल आंदोलन के साथ (जैसे 1 / / Arabidopsis रेपसीड के लिए μg मिलीलीटर और 3 / नॉर्वे सजाना के लिए μg मिलीलीटर). मिक्स और 37 के लिए पहले से गरम डिग्री सेल्सियस 100 मिमी Tris पीएच 8 और 50 मिमी EDTA. स्लाइड्स इलाज से पहले तुरंत proteinase कश्मीर जोड़ें एनबी! proteinase कश्मीर के इलाज के लिए ऊतक, संयंत्र प्रजातियों और उम्र पर निर्भर करता है अनुकूलित की जरूरत है. (NB! ऊष्मायन समय के दौरान 45 कदम में इस्तेमाल किया triethanolamine तैयार) . 1x पीबीएस में 2mg/ml ग्लाइसिन के साथ कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए स्लाइड्स को समझो. (NB! पीबीएस के साथ ग्लाइसिन मिक्स दिन पहले इसे का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि ग्लाइसिन ठीक से भंग कर रहा है). स्लाइड्स 1x पीबीएस में 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धो लें. स्लाइड्स 1x पीबीएस में 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धो लें. 4% (w / v) paraformaldehyde कमरे के तापमान पर बनाया ताजा 1x पीबीएस 7 पीएच के साथ 10 मिनट के लिए स्लाइड्स को सेते हैं. ग्लास कंटेनर का प्रयोग करें. 1x पीबीएस में 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्लाइड्स धो लें. 1x पीबीएस में 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्लाइड्स धो लें. (45 कदम में समाधान में एसिटिक एनहाइड्राइड बांटना). 0.1M triethanolamine (ताजा, 8 पीएच बनाया) और कमरे के तापमान पर एसिटिक एनहाइड्राइड में 10 मिनट के लिए स्लाइड्स को सेते हैं. 1x पीबीएस में 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्लाइड्स धो लें. 1x पीबीएस में 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्लाइड्स धो लें. निर्जलीकरण: 30 सेकंड 30% EtOH 30 सेकंड 60% EtOH 30 सेकंड 80% EtOH 30 सेकंड 90% EtOH 30 सेकंड 95% EtOH 30 2x सेकंड EtOH 100% रोकें! यह संभव है करने के लिए यहाँ बंद करो और चार पर डिग्री सेल्सियस कई घंटे के लिए एक कंटेनर में नीचे में एक EtOH की एक छोटी राशि के साथ स्लाइड्स की दुकान है. 4.2 स्वस्थानी संकरण (Film! तकनीकी विवरण इस फिल्म में दिखाया जाता है) तय है जो के साथ जांच जो उपयोग स्लाइड, दोनों भावना और antisense जांच के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करने के लिए मत भूलना. (NB! ProbeOn प्लस फिशर जैव प्रौद्योगिकी से स्लाइड्स एक सफेद frosting है कि उन्हें प्रोटोकॉल के संकरण / पता लगाने के कदम के दौरान जोड़े में sandwiched की अनुमति देता है.) एक ही एकाग्रता के साथ एक ही जांच एक विशिष्ट स्लाइड जोड़ी पर इस्तेमाल किया जाना चाहिए. कितना संकरण स्लाइड जोड़े की कुल संख्या पर आधारित बनाने के समाधान का निर्धारण करते हैं. Dextran सल्फेट पहले से गरम में 60 डिग्री सेल्सियस संकरण समाधान Dextran सल्फेट से बहुत चिपचिपा है. 60 में संकरण समाधान रखो डिग्री सेल्सियस और इसे संभालना आसान हो जाएगा. साफ कागज तौलिए या Kimwipe / ऊतक कागजात पर स्लाइड्स एयर सूखे से पहले जांच लागू किया जाता है. स्लाइड्स पूरी तरह से सूखे होना चाहिए. स्लाइड्स के प्रत्येक जोड़ी के लिए जांच जोड़ने के. यह अलग जांच सांद्रता (0.5 उदाहरण के लिए, 2 और 4 μl) का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है इष्टतम एकाग्रता खोजने से पहले वास्तविक प्रयोग preformed है. संकरण समाधान 5 स्लाइड जोड़े 10 स्लाइड जोड़े 15 स्लाइड जोड़े 20 स्लाइड जोड़े सीटू लवण में 10x 100 μl 200 μl 300 μl 400 μl विआयनीकृत formamide 400 μl 800 μl 1200 μl 1600 μl 50% Dextran सल्फेट (60 डिग्री सेल्सियस) 200 μl 400 μl 600 μl 800 μl 50x है Denhardt समाधान 20 μl 40 μl 60 μl 80 μl tRNA (100mg/ml) 10 μl 20 μl 30 μl 40 μl एच 2 हे (DEPC इलाज) 70 μl 140 μl 210 μl 280 μl कुल मात्रा 800 μl 1600 μl 2400 μl 3200 μl 20 μl के अंतिम मात्रा RNase मुक्त MilliQ पानी में जांच पतला. (यानी 20 μl) मात्रा 40 μl की कुल मात्रा देने जांच के लिए formamide जोड़ें. 80 के लिए जांच हीट डिग्री सेल्सियस 2 मिनट के लिए. 2 मिनट के लिए बर्फ पर रखें. नीचे स्पिन. बर्फ पर जांच रखें. यह जांच मिश्रण स्लाइड्स की एक जोड़ी के लिए पर्याप्त है. विशिष्ट जांच के लिए स्लाइड जोड़े की कुल संख्या के अनुसार गुणा. स्लाइड्स के प्रत्येक जोड़ी के 200 μl की एक अंतिम प्रत्येक स्लाइड जोड़ी के लिए (यानी 160 μl संकरण + समाधान 40 μl जांच) की मात्रा देने के लिए संकरण समाधान के 160 μl जोड़ें. बुलबुले पैदा बिना मिक्स. एक स्लाइड जांच लागू करें और धीरे धीरे दो स्लाइड्स साथ फ्यूज. (NB! Sandwiching जांच में प्लस, स्लाइड, या समकक्ष स्लाइड्स यदि frosting के बिना स्लाइड्स का इस्तेमाल कर रहे हैं कवर फिसल जाता है के बजाय का उपयोग sandwiching के साथ ही किया जा सकता है.) गीला कागज तौलिए के ऊपर एक प्लास्टिक कंटेनर (मुहरों जो कसकर) प्लास्टिक pipettes का उपयोग करने में स्लाइड्स तरक्की. 50-55 संकरण ° C रातोंरात (12-16 घंटे). 4.3 सीटू पोस्ट संकरण (Film! तकनीकी विवरण इस फिल्म में दिखाया जाता है) में सीटू पोस्ट संकरण में वार्मिंग द्वारा तैयार ~ 2 एल 0.2x एसएससी (55 डिग्री सेल्सियस) और ~ 2 एल 1x NTE (37 डिग्री सेल्सियस) रातोंरात. ज्यादा एसएससी और NTE अगर RNase (57-59 नीचे दिए गए चरणों) उपचार किया जाता है की जरूरत है. गर्म 0.2x एसएससी (ऊपर देखें) में प्रत्येक स्लाइड जोड़ी डुबकी के लिए अलग और उन्हें कुल्ला. फिर एक कंटेनर में एक रैक में उन्हें जगहगर्म 0.2x एसएससी के साथ. कोमल आंदोलन के साथ 0.2x एसएससी में 60 मिनट के लिए 55 स्लाइड्स धो डिग्री सेल्सियस (NB! Boehringer ब्लॉक ऊष्मायन समय के दौरान 63 कदम में इस्तेमाल किया समाधान तैयार करें. ) 60 मिनट के लिए 0.2x एसएससी में धोने दोहराएँ. (यदि RNase कदम इस ऊष्मायन के दौरान RNase पिघलना चलो, अगर जारी रखने के लिए 60 कदम नहीं किया है NB!. ) वैकल्पिक: 5 मिनट गर्म 1x NTE में (ऊपर देखें) के लिए 37 में स्लाइड्स धो डिग्री सेल्सियस कोमल आंदोलन के साथ. वैकल्पिक: 37 पर 5 मिनट के लिए गर्म 1x NTE में धोने दोहराएँ ° कोमल agtation के साथ सी. वैकल्पिक: 37 पर 30 मिनट के लिए (20 μg / मिलीलीटर RNase 1x NTE में एक) RNase ° सी कोमल आंदोलन के साथ साथ स्लाइड्स समझो. फिर 37 पर 1x NTE में 5 मिनट के लिए धो ° सी कोमल आंदोलन के साथ. 1x NTE धोने दोहराएँ. 0.2x एसएससी में 60 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस कोमल आंदोलन के साथ स्लाइड्स का धो लें. (NB! ब्लॉक ऊष्मायन समय के दौरान 64-65 और 67 चरणों में इस्तेमाल किया समाधान तैयार करें. ) कमरे Temp पर 5 1x पीबीएस में न्यूनतम (Pause! पर चार 1XPBS में स्लाइड्स संग्रहीत कर सकते हैं डिग्री सेल्सियस रातोंरात यदि आप अगले दिन जारी रखना चाहते हैं हैं.) के लिए स्लाइड धो नमूना तरफ ऊपर के साथ एक बड़े प्लास्टिक के कंटेनर के तल पर स्लाइड रखें. % 1 100 मिमी Tris 7.5 पीएच, कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए 150 मिमी NaCl में Boehringer ब्लॉक के साथ स्लाइड्स सेते हैं. बस अवरुद्ध समाधान के साथ स्लाइड्स को कवर. है जबकि स्लाइड्स अभी भी प्लास्टिक के कंटेनर में हैं या एक नया कंटेनर में स्लाइड्स जगह अवरुद्ध समाधान डालो. जब बंद समाधान डालने के लिये स्लाइड आमतौर पर प्लास्टिक के कंटेनर का पालन, लेकिन यकीन है कि वे कंटेनर बंद बाहर गिर नहीं है. 100 मिमी Tris 7.5 पीएच, 150 मिमी NaCl, 0.3% Triton एक्स-100 में 1.0% BSA के साथ Boehringer ब्लॉक समाधान बदलें. प्रदर्शन के रूप में 63 कदम में ऊष्मायन. BSA / / Tris / NaCl ट्राइटन कदम से 64 समाधान में विरोधी खुदाई एंटीबॉडी (1:1250 10 मिलीलीटर BSA में, यानी 8 μl एंटीबॉडी) पतला. एक प्लास्टिक में एंटीबॉडी समाधान के एक पोखर बनाओ पकवान तौलना. सैंडविच साथ स्लाइड केशिका बलों समाधान खींचने के लिए अनुमति देते हैं. Kimwipe / टिशू पेपर पर नाली और दोहराने, बुलबुले से बचने के की कोशिश करो. प्लास्टिक के कंटेनर में गीला कागज तौलिये के ऊपर स्लाइड्स तरक्की और स्लाइड्स कमरे Temp पर 2 घंटे के लिए बैठने के लिए अनुमति देते हैं. Kimwipe / टिशू पेपर और अलग स्लाइड्स नाली. प्लास्टिक के कंटेनर के तल पर 63 कदम के रूप में रखें. समाधान BSA / / Tris / NaCl ट्राइटन में 4x धो लें. 15 मिनट हर बार, कमरे के तापमान पर कोमल आंदोलन. 10 मिनट 100 मिमी Tris 9.5 पीएच, 100 मिमी NaCl, 50 मिमी 2 MgCl. प्लास्टिक के कंटेनर के तल पर 63 कदम के रूप में रखें. Tris पीएच 9.5/NaCl/MgCl 2 समाधान में डुबकी स्लाइड पर डिटर्जेंट के सभी सुनिश्चित धोया है. सैंडविच बनाओ और 65 के रूप में पश्चिमी नीले समाधान आकर्षित. एक बार दोहराएँ. कमरे के तापमान पर 1-5 दिनों के लिए कुल अंधेरे (टिन पन्नी में लपेटो) में गीला कागज तौलिये के ऊपर प्लास्टिक के कंटेनर में रखें स्लाइड. 12 6, और एक बार तो 24 घंटे के हर दिन के बाद की जाँच करें. नाली स्लाइड्स, 1xTE में कुल्ला की प्रतिक्रिया को रोकने के. कवर फिसल जाता है पर रखो पहले स्लाइड माइक्रोस्कोप में जांच कर रहे हैं. स्लाइड्स 1x ते में कई महीनों के लिए बचाया जा सकता है, लेकिन तस्वीरें जितनी जल्दी हो सके ले. व्यंजनों / शेयर समाधान नो बॉल! RNase मुक्त जितना संभव हो, जैसे MilliQ पानी DEPC इलाज MilliQ – पानी (0.1% DEPC जोड़ें रातोंरात. आटोक्लेव छोड़ दो (15 साई में 20 मिनट., यानी 1.05 किग्रा / 2 सेमी तरल चक्र पर,) या में उपयोग का प्रयोग करें कम से कम MilliQ – पानी. autoclaved जब buffers और स्टॉक समाधान की तैयारी यह भी संभव है DEPC इलाज पानी में RNase मुक्त आदि buffers और खुद को शेयर समाधान DEPC इलाज करने के बजाय, लवण भंग यदि आप DEPC पानी का इलाज नहीं है. , buffers और शेयर समाधान, कम से कम आटोक्लेव या फिल्टर उन्हें बाँझ. रोकें! कमरे के तापमान पर स्टोर और buffers शेयर समाधान, नहीं तो और कहा गया है. नो बॉल! तुम buffers के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उन्हें कैसे आण्विक क्लोनिंग में बनाने के लिए (Sambrook, जे, और DW रसेल 2001. पर संकेत के कई आण्विक क्लोनिंग एक प्रयोगशाला मैनुअल. 3 एड ठंडा. स्प्रिंग हार्बर लेबोरेटरी प्रेस, कोल्ड स्प्रिंग हार्बर मिल कर सकते हैं. न्यूयॉर्क, संयुक्त राज्य अमरीका). 0.1M triethanolamine में एसिटिक एनहाइड्राइड (8 पीएच, मात्रा: 800 मिलीलीटर). घटक मात्रा राशि / अंतिम एकाग्रता Triethanolamine 10.4 मिलीलीटर 0.1 एम triethanolamine MilliQ पानी 786.4 मिलीलीटर अंतिम मात्रा 800 मिलीलीटर एचसीएल 3.2 मिलीलीटर पीएच दे8.0 एसिटिक एनहाइड्राइड 4.8 मिलीलीटर 0.6% 0.1 एम triethanolamine बफर, 8.0 पीएच, पतला एच 2 हे 786.4 मिलीलीटर में 10.4 triethanolamine मिलीलीटर बनाने के लिए और 8.0 (पीएच सूचक के साथ जांच) पीएच लाने के लिए एचसीएल की 3.2 मिलीलीटर जोड़ने. टूटी हुई 10 मिलीलीटर प्लास्टिक pipettes या triethanolamine के नीचे में हलचल पट्टी के साथ एक कंटेनर में इसी तरह के साथ स्लाइड रैक तरक्की. में इतना है कि यह अच्छी तरह से मिश्रित है स्लाइड डालने से पहले कुछ ही मिनटों triethanolamine में 4.8 मिलीलीटर एसिटिक एनहाइड्राइड बग़ैर. नो बॉल! 0.1M triethanolamine ताजा और ऊष्मायन पहले बस जोड़ एसिटिक एनहाइड्राइड बनाओ. नो बॉल! ग्लास कंटेनर का प्रयोग करें. Triethanolamine बफर के लिए इस्तेमाल किया जा है, क्योंकि पानी में एसिटिक एनहाइड्राइड अस्थिर है. Agarose जेल (1%) x 1 TBE में (मात्रा: 100 मिलीलीटर) घटक मात्रा राशि / अंतिम एकाग्रता Agarose 1 ग्राम % 1 1 एक्स TBE 100 मिलीलीटर तक 1 x TBE के साथ मिक्स agarose. हीट / उबालें जब तक agarose पिघल गया है. एक जेल कास्ट. एक 1 x TBE बफर में जेल चलाएँ. Dextran सल्फेट DEPC इलाज MilliQ पानी (यानी 50% (w / v)) के साथ 5 ग्राम Dextran सल्फेट 10 मिलीलीटर के लिए पतला और 60 डिग्री सेल्सियस में भंग रोकें! -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर 0.5 एम EDTA pH8.0 (titriplex III, मात्रा 500 मिलीलीटर) घटक मात्रा राशि / अंतिम एकाग्रता EDTA (372.24 छ / mol) 93.06 छ 0.5 एम EDTA MilliQ पानी 500 मिलीलीटर तक NaOH ~ 10 ग्राम छर्रों 8.0 पीएच दे DEPC 0.5 मिलीलीटर 0.1% DEPC पानी (8.0 पीएच पर होता) में EDTA भंग, 500 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा को समायोजित करें. 0.1% DEPC जोड़ें. रात खत्म छोड़ो. आटोक्लेव. 4% (w / v) 1x Pbs, पीएच 7.0 (650 मिलीलीटर) paraformaldehyde – / समाधान (1-3 चरणों, 42) लगानेवाला ठीक घटक मात्रा राशि / अंतिम एकाग्रता MilliQ पानी 585 मिलीलीटर 10x पीबीएस 65 मिलीलीटर 1x पीबीएस 10M NaOH 520 μl दे पीएच ~ 11 Paraformaldehyde 26 छ 4% केंद्रित एचसीएल 449 μl दे पीएच ~ 7 मिक्स पानी, Pbs और NaOH और 60-70 के लिए गर्मी डिग्री सेल्सियस (तापमान और उच्च pH यह आसान paraformaldehyde भंग करने के लिए कर देगा. (धूआं हुड में) paraformaldehyde जोड़ें. जब समाधान मंजूरी दे दी है यह बर्फ पर जगह और 449 μl केंद्रित एचसीएल जोड़कर पीएच को 7,0 करने के लिए समायोजित. नो बॉल! ताजा बनाओ. नो बॉल! सजाना प्रोटोकॉल glutaraldehyde में 0.25%, यानी 6.5 मिलीलीटर 25% की कुल मात्रा 650 मिलीलीटर या 10 मिलीलीटर 1000 मिलीलीटर की कुल मात्रा का 25% glutaraldehyde glutaraldehyde के अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ा गया है (एक समान के साथ पानी कम याद ) की मात्रा. नो बॉल! बीच 20 और / या ट्राइटन X-100, की कुछ बूँदें जोड़ें के बाद पीएच समायोजित है, सतह के तनाव को कम करने के लिए 1-3 चरणों में निर्धारण की सुविधा . 42 कदम में उपयोग नहीं करते! नो बॉल! जब संयंत्र के ऊतकों लगानेवाला एक छोटी मात्रा (जैसे 100 – 200 मिलीलीटर) फिक्सिंग के आम तौर पर की जरूरत है. सीटू लवण में 10x (मात्रा 100 मिलीलीटर) घटक मात्रा राशि / अंतिम एकाग्रता 5 एम NaCl 60 मिलीलीटर 3M NaCl 1 एम Tris सीएल 8.0 पीएच 10 मिलीलीटर 0.100 एम Tris 1 एम ना फास्फेट पीएच 6.8 10 मिलीलीटर 0.100 एम ना फास्फेट 0.5 एम EDTA 10 मिलीलीटर 0.050 एम EDTA MilliQ पानी 100 मिलीलीटर तक 6.8 पीएच (46.3 मिलीलीटर 1 ना 2 HPO एम 4 + 53.7 मिलीलीटर 1 नाह एम 2 पीओ 4) के साथ एक ना फास्फेट बफर मिक्स . मिक्स NaCl, Tris, ना फॉस्फेट बफर, EDTA और पानी. आटोक्लेव. रोकें! -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर 4 एम 2 LiCl (लिथियम क्लोराइड, मात्रा: 100 मिलीलीटर) घटक मात्रा राशि / अंतिम एकाग्रता 2 (42.39 छ / mol) LiCl 16.956 ग्राम 4M 2 LiCl MilliQ पानी 100 मिलीलीटर तक DEPC 0.1 मिलीलीटर 0.1% DEPC पानी में भंग LiCl 2, 100 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा को समायोजित करें. 0.1% DEPC जोड़ें. रात खत्म छोड़ो. आटोक्लेव. रोकें! 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस 1 एम 2 MgCl · एच 2 हे (मैग्नीशियम क्लोराइड की मात्रा: 100 मिलीलीटर) घटक मात्रा राशि / अंतिम एकाग्रता MgCl 2 · एच 2 हे (203.30 छ / mol) 20.33 छ एम 1 2 MgCl · एच 2 हे MilliQ पानी 100 मिलीलीटर तक DEPC 0.1 मिलीलीटर 0.1% DEPC पानी में भंग MgCl 2, 100 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा को समायोजित करें. 0.1% DEPC जोड़ें. रात खत्म छोड़ो. आटोक्लेव. नो बॉल! MgCl 2 बहुत हीड्रोस्कोपिक है. समय की लंबी अवधि के लिए खोला बोतल की दुकान मत करो . 5 एम NaCl (सोडियम क्लोराइड की मात्रा: 1 एल) घटक मात्रा राशि / अंतिम एकाग्रता NaCl (58.44 छ / mol) 292.2 छ 5 एम NaCl MilliQ पानी 1l के लिए DEPC 1 मिलीलीटर 0.1% DEPC पानी में NaCl भंग, एक एल के अंतिम मात्रा को समायोजित 0.1% DEPC जोड़ें. रात खत्म छोड़ो. आटोक्लेव. एम 1 NaOAc 4.7 पीएच (सोडियम एसीटेट, मात्रा: 100 मिलीलीटर) घटक मात्रा राशि / अंतिम एकाग्रता NaOAc (82.03 छ / mol) 0.8203 जी 1 एम NaOAc MilliQ पानी 100 मिलीलीटर तक एसिटिक एसिड 4.7 पीएच दे DEPC 0.1 मिलीलीटर 0.1% DEPC पानी में भंग NaOAc. पीएच 4.7 करने के लिए समायोजित करें. 100 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा को समायोजित करें. 0.1% DEPC जोड़ें. रात खत्म छोड़ो. आटोक्लेव. 0.2 एम ना 2 3 सीओ pH11.4 (सोडियम कार्बोनेट, मात्रा: 10 मिलीलीटर) घटक मात्रा राशि / अंतिम एकाग्रता ना सीओ 2 3 </sub> पर ०.२११९८ जी 0.2 एम ना सीओ 2 3 पीएच = 11.4 MilliQ पानी 10 मिलीलीटर तक पानी में सीओ 2 3 ना भंग, 10 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा को समायोजित. पीएच 11.4 होना चाहिए. नो बॉल! ताजा बनाओ. 0.2 एम NaHCO pH8.2 3 (सोडियम बिकारबोनिट, मात्रा: 10 मिलीलीटर) घटक मात्रा राशि / अंतिम एकाग्रता 3 NaHCO ०.१६,८०२ जी 0.2 एम NaHCO 3: पीएच 8.2 = MilliQ पानी 10 मिलीलीटर तक पानी में 3 NaHCO भंग, 10 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा को समायोजित. पीएच 8.2 होना चाहिए. नो बॉल! ताजा बनाओ. 1 एम ना 2 4 HPO · 2 एच 2 हे (मात्रा 500 मिलीलीटर) घटक मात्रा राशि / अंतिम एकाग्रता ना दो HPO 4 · 2 एच 2 हे (177.99 छ / mol) 88.995 ग्राम 1 एम ना 2 4 HPO MilliQ पानी 500 मिलीलीटर तक DEPC 0.5 मिलीलीटर 0.1% DEPC पानी में भंग ना दो चार HPO, 500 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा को समायोजित करें. 0.1% DEPC जोड़ें. रात खत्म छोड़ो. आटोक्लेव. एम 1 नाह 2 पीओ 4 · एच 2 हे (मात्रा 500 मिलीलीटर) घटक मात्रा राशि / अंतिम एकाग्रता नाह दो पीओ 4 · एच 2 हे (137.99 छ / mol) 68.995 ग्राम एक नाह एम 2 पीओ 4 MilliQ पानी 500 मिलीलीटर तक DEPC 0.5 मिलीलीटर 0.1% DEPC नाह भंग 2 पीओ पानी में 4, 500 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा को समायोजित करें. 0.1% DEPC जोड़ें. रात खत्म छोड़ो. आटोक्लेव. 5x NTE (कुल मात्रा: 1l) घटक मात्रा राशि / अंतिम एकाग्रता 5 एम NaCl 500 मिलीलीटर 2.5 एम NaCl 1 एम Tris सीएल 8 पीएच 25 मिलीलीटर 50 मिमी Tris सीएल 8 पीएच 0.5 एम EDTA 5 मिलीलीटर 5 मिमी EDTA MilliQ पानी 470 मिलीलीटर अंतिम मात्रा 1l मिक्स NaCl, Tris, EDTA और पानी. DEPC का इलाज नहीं करो. आटोक्लेव. X 10 (खारा फॉस्फेट-buffered) 7.0 पीएच (1l कुल मात्रा) पीबीएस घटक मात्रा राशि / अंतिम एकाग्रता 5 एम NaCl 260 मिलीलीटर 1.3 एम NaCl 1 एम ना 2 4 HPO 70 मिलीलीटर 70 मिमी ना 2 4 HPO एक नाह एम 2 पीओ 4 30 मिलीलीटर 30 मिमी नाह 2 4 पीओ MilliQ पानी 640 मिलीलीटर अंतिम मात्रा 1l DEPC 1 मिलीलीटर 0.1% DEPC मिक्स NaCl, ना 2 4 HPO, नाह 2 4 पीओ और पानी. एचसीएल के साथ पीएच 7.0 पीएच को समायोजित करें. 0.1% DEPC जोड़ें. रात खत्म छोड़ो. आटोक्लेव. 20x एसएससी पीएच 7.0 (कुल मात्रा: 1l) घटक मात्रा राशि / अंतिम एकाग्रता NaCl (58.44 छ / mol) 175.32 जी 3 एम NaCl ना साइट्रेट (294.1 छ / mol) 88.23 छ 0.300 एम ना साइट्रेट MilliQ पानी 1 मैं एचसीएल 7.5 पीएच दे DEPC 1 मिलीलीटर 0.1% DEPC भंग ~ 800 मिलीलीटर पानी में NaCl और ना साइट्रेट. एचसीएल के साथ पीएच 7.0 पीएच को समायोजित करें. पानी के साथ 1 एल मात्रा समायोजित करें. 0.1% DEPC जोड़ें. रात खत्म छोड़ो. आटोक्लेव. 5 x TBE (मात्रा: 1l) घटक मात्रा राशि / अंतिम एकाग्रता Tris (121.14 छ / mol) 54 छ ~ 0.45 एम Tris बोरिक एसिड (61.83 छ / mol) 27.5 छ ~ 0.45 एम बोरिक एसिड EDTA (372.24 छ / mol) 3.7 छ ~ 0.01 एम EDTA MilliQ पानी 1l के लिए मिक्स Tris, बोरिक एसिड, EDTA और पानी. पीएच 8.3 ~ होना चाहिए. 1 x TBE उपयोग करने से पहले पतला. X 10 ते 8.0 पीएच (Tris EDTA, मात्रा: 1l) घटक मात्रा राशि / अंतिम एकाग्रता 1 Tris-सीएल, पीएच 8.0 एम 100 मिलीलीटर 0.100 Tris-सीएल एम 0.5 एम EDTA pH8.0 100 मिलीलीटर 0.050 एम EDTA MilliQ पानी 1l के लिए मिक्स Tris, EDTA और पानी. DEPC का इलाज नहीं करो. आटोक्लेव. नो बॉल! Tris DEPC का इलाज नहीं किया जाना चाहिए! RNase मुक्त पाउडर का प्रयोग करें और MilliQ – पानी DEPC-treated/RNase-free के साथ पतला . 1 एम Tris – एचसीएल 7.5 पीएच – 9.5 (मात्रा 500 मिलीलीटर) घटक मात्रा राशि / अंतिम एकाग्रता Tris (121.14 छ / mol) 60.57 छ 1 एम Tris MilliQ पानी 500 मिलीलीटर तक एचसीएल 7.5 पीएच दे एचसीएल 8.0 पीएच दे NaOH 9.5 पीएच दे Tris DEPC इलाज पानी में भंग. वांछित पीएच को समायोजित करें. 500 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा को समायोजित करें. आटोक्लेव. नो बॉल! Tris DEPC का इलाज नहीं किया जाना चाहिए! RNase मुक्त पाउडर का प्रयोग करें और MilliQ – पानी DEPC-treated/RNase-free के साथ पतला . नो बॉल! आण्विक क्लोनिंग में (ऊपर देखें) वहाँ एक तालिका का वर्णन कितना ध्यान केंद्रित एचसीएल सही पीएच प्राप्त करने की आवश्यकता है. सामग्री और विधियों स्वस्थानी प्रोटोकॉल में ऊपर और फिल्म में प्रस्तुत किया है . संयंत्र सामग्री और जांच इस विशिष्ट उदाहरण में प्रयोग किया जाता के यहाँ अतिरिक्त जानकारी वर्णित हैं. संयंत्र सामग्री और प्रयोगात्मक डिजाइन Picea abies से पुरुष शंकु [एल] karst. (नॉर्वे सुथरा) ​​अपसला, स्वीडन, शरद ऋतु 2007 में एकत्र किए गए थे. आठ शंकु sectioned और वर्गों से थेप्रत्येक शंकु प्रत्येक उपचार में इस्तेमाल किया गया. तीन proteinase कश्मीर सांद्रता का परीक्षण किया गया, 1, 3 और 5 μg / μl और प्रत्येक एकाग्रता RNase के साथ या बिना इलाज किया गया. RNase के साथ इलाज नहीं स्लाइड्स पीबीएस में RNase उपचार के दौरान छोड़ दिया गया Arabidopsis thaliana [एल] Heynh. और बै्रसिका napus एल 22 के साथ एक संस्कृति कक्ष में नियंत्रित परिस्थितियों में बड़े हो रहे थे ° C/18 डिग्री सेल्सियस दिन / रात के तापमान और 16 एच. के एक photoperiod युवा फूलों की कलियों, 0-10 चरणों (चरणों अनुसार 5 Smyth) युक्त inflorescences अध्ययन किया गया. क्रेना जांच कुल शाही सेना पी. से पृथक किया गया abies पुरुष शंकु के रूप में पहले वर्णित 6 और ए से thaliana और बी TRIzol (BRL Gibco, फ्रेडरिक, मेरीलैंड, संयुक्त राज्य अमरीका) और Qiagen RNeasy संयंत्र मिनी किट (Qiagen, Hilden, जर्मनी) का उपयोग कर, क्रमशः 'निर्माताओं की सिफारिशों के अनुसार में , napus. सीडीएनए 0.5-1 μg कुल शाही सेना, प्रजातियों पर निर्भर करता है, निर्माता के निर्देशों का पालन सुपरस्क्रिप्ट III रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (Invitrogen, Carlsbad, कैलिफोर्निया, संयुक्त राज्य अमेरिका) का उपयोग कर से संश्लेषित किया गया था AtAP3 और BnAP3 भावना और antisense टुकड़े और पी.. abies भावना टुकड़े अलग थे और जीन विशिष्ट प्राइमरों (1 टेबल) का उपयोग DAL13 antisense टुकड़े. पृथक थे और 7 में प्राइमरों का उपयोग प्रवर्धित प्रवर्धित. T7 अधिकता ए से टुकड़े को जोड़ा गया thaliana और पी. संशोधित रिवर्स अनुक्रम T7 (तालिका 1) ले जाने प्राइमरों का उपयोग abies . एक 500 बीपी टुकड़ा BnAP3 विशिष्ट प्राइमरों (1 टेबल) का उपयोग कर पृथक किया गया और एक T7-promotor के साथ एक सदिश pGEM-टी में क्लोन. पी. abies के लिए टुकड़े सभी पीसीआर प्रतिक्रियाओं 20 μl 0.2 यू Phusion युक्त उच्च Fidility पोलीमरेज़ डीएनए (Finnzymes, एस्पो, फिनलैंड), 1x Phusion HF बफर, प्रत्येक dNTP के 200 सुक्ष्ममापी, प्रत्येक के 0.3 सुक्ष्ममापी के अंतिम मात्रा में प्रदर्शन किया गया किताब और 25-50 एनजी सीडीएनए और एक मानक पीसीआर कार्यक्रम 60-55 डिग्री सेल्सियस (स्पर्श नीचे डिग्री सेल्सियस चक्र / -1) 55 द्वारा पीछा डिग्री सेल्सियस तापमान annealing के साथ इस्तेमाल किया गया था निर्माता की सिफारिशों और लंबी जांच के अनुसार लगभग 100-150 बीपी के लिए पचा थे; नब्ज और antisense सभी तीन प्रजातियों के लिए क्रेना जांच डीआईजी आरएनए लेबल (Roche एप्लाइड साइंस, मैनहेम, जर्मनी SP6/T7) किट का उपयोग कर इन विट्रो प्रतिलेखन में साथ थे संश्लेषित 3 के अनुसार एक ना सीओ 2 3 बफर का उपयोग कर टुकड़े. परिणामों के परिणाम में यहाँ अनुभाग हम सीटू प्रयोगों में से विशिष्ट परिणामों के तीन अलग अलग उदाहरण का वर्णन करता है. आनुवंशिक तंत्र है कि gymnosperms और आवृत्तबीजी वनस्पतियों में निर्दिष्ट नर और मादा अंग पहचान द्वारा प्रजनन विकास को नियंत्रित है कि 285 मिलियन वर्ष 10 पहले दो बीज संयंत्र प्रजातियों अलग के बावजूद विकासवादी संरक्षित 7-9 प्रतीत होता है. ए में thaliana पुष्प homeotic APETALA3 (11 AP3) और PISTILLATA जीन (12 पीआई) आवश्यक है और एक फूल के संदर्भ के भीतर पुरुष प्रजनन विकास निर्दिष्ट करने के लिए पर्याप्त हैं, और इस समारोह के angiosperm भीतर 13 वंश संरक्षित प्रतीत होता है. Gymnosperms, जो फूल की कमी है और उनके प्रजनन अंगों को अलग पुरुष और महिला (चित्र 1 ए सी) शंकु, जीन में व्यवस्थित मुताबिक़ AP3 पीआई और विशेष रूप से पुरुष शंकु, 7,14 microsporophylls के पराग असर अंगों में व्यक्त कर रहे हैं. इसलिए, दोनों आवृत्तबीजी वनस्पतियों और gymnosperms में जीनों के मुताबिक़ एक समान सेट पराग – असर अंगों को परिभाषित करता है. जीन विशिष्ट AtAP3 और BnAP3, क्रमशः के खिलाफ निर्देशित जांच, दो वोर्ल के लिए इसी क्षेत्र में युवा पुष्प कलियों में चरण 3 से संकेतों और ए में तीन दी thaliana और बी napus. बाद में कलियों संकेतों पंखुड़ी और पुंकेसर (छवि 2A और बी) के विकास के लिए प्रतिबंधित किया गया मंचन किया. इन परिणामों पिछले 11,15,16 पढ़ाई के साथ समझौते में हैं. पी. में AP3 homologue की ओर निर्देशित जांच abies, DAL13, पी. के microsporophylls में संकेतों का उत्पादन abies पुरुष शंकु शिखर meristem समाप्ति के पहले और बाद में दोनों (छवि 2C और डी), के रूप में पिछले 7,14 अध्ययन से उम्मीद है. नब्ज जांच पृष्ठभूमि (3A बी छवि और डेटा नहीं दिखाया) ऊपर कोई संकेत दिया. साथ में ले ली, इन परिणामों ए की अभिव्यक्ति का प्रदर्शन thaliana AP3 और बी में अपनी orthologs napus और पी. पुरुष प्रजनन अंगों के विकास में abies. चित्रा 1 A.thaliana और बी. napus फूल और पराग शंकुवृक्ष पी. के पुरुष शंकु उत्पादन abies चित्र पुष्प कलियों और A.thaliana और B.napu के खुले फूलों के साथ दिखाने के inflorescencesए और बी क्रमशः. ध्यान दें कि angiosperm बाँझ perianth से अलग फूल दोनों पुरुष और महिला प्रजनन अंगों harbors; पुंकेसर और carpels. सी में दिखाया गया है एक gymnosperm पी. की टहनी हरी वनस्पति सुइयों और लाल प्रजनन पुरुष शंकु के साथ abies . चित्रा 2 ए की अभिव्यक्ति. thaliana AP3 और बी में मुताबिक़ जीन napus और पी. abies. Micrographs ए के अनुदैर्ध्य वर्गों दिखाने thaliana और बी ए और बी क्रमशः, और पी. में napus inflorescences सी और डी में abies पुरुष शंकु. Antisense AtAP3 के खिलाफ दूसरे और तीसरे वोर्ल फूलों अंगों में ए और बी में BnAP3 शो संकेत में निर्देशित जांच के साथ संकरित धारा. संख्या 5 Smyth के अनुसार पुष्प चरणों इंगित करता है. Antisense जांच DAL13 जीन की ओर निर्देशित पी. के पराग असर microsporophylls में संकेत दिया abies पुरुष शंकु, जैसा कि सीडी में दिखाया गया है. Microsporophylls के उदाहरण तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं. ई. बिंदु में संकरण संकेत arrowheads, जो बैंगनी रंग के रूप में प्रकट होता है. सी और डी में phenolic यौगिकों केंद्रीय मज्जा में व्यक्ति की कोशिकाओं के लिए भूरा unspecific रंग दे. एस, फूल की पँखड़ी का भाग, पी, पत्ती, अनुसूचित जनजाति, पराग – केसर, ग, कापेल, एमएस, microsporophyll, अनुकरणीय, मज्जा, पीपी, पूर्व – पराग कोशिकाओं. बार: 100 सुक्ष्ममापी. चित्रा 3. पी. से पुरुष शंकु में DAL13 अभिव्यक्ति abies. सब (मुख्यालय) micrographs, शिखर meristem समाप्ति के बाद पुरुष शंकु के अनुदैर्ध्य वर्गों दिखा रहे हैं. Arrowheads सेल प्रकार जिसमें DAL13 व्यक्त की है करने के लिए बिंदु. एक बी और धारा भावना को नियंत्रित करने के लिए पृष्ठभूमि धुंधला निर्धारित जांच के साथ संकरित हैं. एच सी micrographs DAL13 antisense जांच के साथ संकरित हैं . RNase उपचार के साथ और बिना प्रयोगों से धारा डी, एफ, एच और सी, ई, जी क्रमशः में दिखाए जाते हैं. 100 सुक्ष्ममापी: 1 μg / एमएल proteinase कश्मीर के साथ प्रयोगों से micrographs सी और डी, 3 μg / ई और एफ में मिलीलीटर, और 5 μg / जी और एच. बार में मिलीलीटर में दिखाए जाते हैं.

Discussion

पी. के दो पहलुओं abies प्रोटोकॉल ए तुलना अनुकूलित थे thaliana बी / napus प्रोटोकॉल, RNase उपचार और proteinase कश्मीर एकाग्रता. RNase पृष्ठभूमि संकेतों को निकालता है और इस ^{प्रकार} संकेत विशिष्टता 17 बढ़ जाती है. proteinase कश्मीर के इलाज के लिए ऊतकों permeabilize ताकि जांच दर्ज करें और ब्याज की शाही सेना पूल संकरण कर सकते हैं की जरूरत है. DAL13 antisense जांच RNase के लिए 30 मिनट (चित्रा 2 डी, एफ और एच) के साथ इलाज वर्गों की तुलना में RNase उपचार (छवि -3 सी, ई, जी) के बिना एक उच्च संकेत दिया. चूंकि RNase उपचार संकेत वृद्धि नहीं था यह प्रोटोकॉल से हटा दिया गया था. 1, 3 और 5 μg / मिलीलीटर; proteinase कश्मीर उपचार के तीन अलग अलग सांद्रता में परीक्षण किया गया. पी. के मामले में abies एक कम या कोई संकेत 1 μg / एमएल proteinase कश्मीर (छवि -3 सी – डी) का उपयोग कर मनाया गया. दोनों μg 3 / मिलीलीटर (छवि 3E – एफ) और 5 μg / एमएल के साथ एक मजबूत संकेत प्राप्त किया गया था (3 जी – एच छवि) proteinase लालकृष्ण जब सिग्नल की शक्ति में कोई स्पष्ट अंतर के बाद से 5 μg / एमएल proteinase कश्मीर का उपयोग करते हुए पाया गया 3 μg / मिलीलीटर की तुलना में, हम हमारे प्रोटोकॉल में 3 μg / मिलीलीटर का उपयोग करने के लिए चुना. यह संभावना है कि पी. में एक उच्च proteinase कश्मीर एकाग्रता की जरूरत abies पुरुष शंकु ए की तुलना में thaliana और बी napus पुष्प कलियों phenolics और polysaccharides के उच्च स्तर के साथ और अधिक कॉम्पैक्ट के ऊतकों को कारण है .

निर्धारण के दौरान और ए के बीच कुछ मतभेद को एम्बेड thaliana बी / napus प्रोटोकॉल और पी. abies प्रोटोकॉल स्पष्ट कर रहे हैं. ब्याज की ऊतक आरएनए प्रतिधारण उपलब्ध कराने के लिए तय हो गई है और यह एक महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि खराब तय सामग्री भले ही mRNA अत्यधिक प्रचुर मात्रा में है एक कम या undetectable संकेत दे सकता है. निर्जलित ऊतक है, मंजूरी दे दी है और ऊतकों को नुकसान से बचने के क्रमिक परिवर्तन में मोम में एम्बेडेड, और कुछ प्रोटोकॉल NaCl में 0.85% निर्जलीकरण में इथेनॉल के लिए जोड़ा जाता है के लिए आगे ^{संकोचन} और 3 कोशिकाओं की सूजन से बचने के. एम्बेडिंग के दौरान निर्जलीकरण कदम बर्फ पर प्रदर्शन किया जा सकता है कम से कम RNase गतिविधि रखने के लिए. पी. में abies प्रोटोकॉल 4% paraformaldehyde तय समाधान 0.25% glutaraldehyde है, जो एक बेहतर आरएनए ^{प्रतिधारण} 17 देने के लिए भले ही है कि कुछ का तर्क है कि ^यह शायद कोई 3 फर्क कर माना जाता है शामिल हैं. स्लाइड्स पर सामग्री सेक्शनिंग करने के बाद तय हो गई है और संकरण से पहले pretreated (यानी dewaxed rehydrated, permeabilized, जांच के बंधन गैर विशिष्ट और अंत में निर्जलित को कम करने के लिए इलाज).

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल में पूरे पता लगाने की प्रक्रिया आम प्रयोगशालाओं में प्रदर्शन किया जा सकता है, संकेत आमतौर पर 1-3 दिनों के भीतर विकसित और पृष्ठभूमि पर संकेत के बीच का अनुपात लगातार नजर रखी जा सकती है. डीआईजी-लेबल जांच आमतौर पर एक अधिक विशिष्ट संकेत दे रेडियोधर्मी लेबल जांच करने के लिए तुलना में, अधिक स्थिर हैं और लगातार प्रयोगों में reused किया जा सकता है. दूसरी ओर, रेडियोधर्मी ¹⁷ जांच करने के लिए तुलना में संवेदनशीलता कम है स्वस्थानी संकरण में अभिव्यक्ति का पता लगाता है एक निश्चित mRNA के लिए एक लेबल विशिष्ट जांच का उपयोग कर. रेडियो लेबलिंग एक मजबूत और संवेदनशील लेबलिंग विधि है, लेकिन यह रेडियोधर्मिता की हैंडलिंग की आवश्यकता है और यह कई सप्ताह लगते हैं पहले परिणाम पता लगाया जा सकता है. दूसरे हाथ पर एंटीजन लेबल जांच, अधिक स्थिर है, कम खतरनाक होते हैं और ^कुछ केवल 17 दिनों के लिए पता लगाने के माध्यम से संपर्क की आवश्यकता है. इस प्रकार, प्रतिजन लेबलिंग तरीकों वर्तमान में हावी रहे हैं. सबसे महत्वपूर्ण कदम प्रोटोकॉल की परवाह किए बिना जांच डिजाइन है. देखभाल करने के लिए यकीन है कि जांच एक उच्च विशिष्टता है और उच्च गुणवत्ता UTPs के साथ लेबल बनाने के लिए लिया जाना चाहिए. कभी कभी संकरण तापमान और / या प्रतिक्रिया लंबाई विशिष्ट जांच के लिए समायोजित किया जाना है.

हमारी संशोधित डीआईजी लेबल जांच पर आधारित प्रोटोकॉल ए से लेकर प्रजातियों में mRNA अभिव्यक्ति के स्थानीयकरण के साथ सुविधा होगी पी. के लिए thaliana abies, और अन्य प्रजातियों के पौधे में मामूली समायोजन के साथ प्रयोग करने योग्य होना चाहिए . प्रोटोकॉल, पुरुष शंकु के बगल में है, भी वनस्पति शूटिंग के विभिन्न चरणों पर परीक्षण किया और दोनों पी. से zygotic और दैहिक भ्रूणों में अच्छे परिणाम (. Karlgren एट अल अप्रकाशित परिणाम) के साथ abies .

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Acetic anhydride		Sigma-Aldrich	A6404-200ml	minimum 98%
Acrylamide, linear		Ambion	9520
Anti-DIG-antibodies		Roche Applied Science
Blocking reagent		Roche Applied Science	11 175 041 910 or 11 096 176 001
Bovine serum albumin		Sigma-Aldrich	A7030-50g	minimum 98%
Deionized formamide		Sigma-Aldrich
Denhardts solution		Sigma-Aldrich	D2532-5ml
DEPC, diethylpyrocarbonate		Sigma-Aldrich
Dextran sulfate		Sigma-Aldrich
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)		Roche Applied Science	11175025910
Glutaraldehyde (25%)		Histolab products AB
Glycogen		Ambion	9510G
Histoclear II		Histolab products AB		You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.
Histowax		Histolab products AB		Histowax or Paraplast can be used for embedding.
Paraformaldehyde		Sigma-Aldrich	P6148-500g
Paraplast plus		Sigma-Aldrich	P3683-1kg	Histowax or Paraplast can be used for embedding.
Phusion™ High-Fidility DNA Polymerase		Finnzymes
Probe-on Plus slides		Fischer Scientific	22-230-900
Proteinase K		Sigma-Aldrich	P2308-5mg
RNase A		Sigma-Aldrich	R5503-100mg
Tissue-clear		Sakura Finetek Europé BV		You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.
Triethanolamine		Sigma-Aldrich	T1377-100ml	minimum 98%
Triton X-100		use your standard product in the lab		Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.
tRNA		Sigma-Aldrich	83853-100mg
Tween-20		use your standard product in the lab		Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.
Western Blue		Promega Corp.