Method Article

의 준비 Drosophila 태아

DOI:

10.3791/1206

⸱

March 13th, 2009

 ,  , 
1Department of Biology, University of Waterloo

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

라이브 영상 분석을위한 Drosophila의 배아를 준비, 간단한 저렴하고 효과적인 방법이 제공됩니다. 우리 프로토콜은 습도와 가스 교환을 제공하고 Drosophila의 배아를 압축하지 않습니다. 이 방법은 stereomicroscope 또는 수직 복합 현미경을 사용하여 Drosophila의 배아의 GFP 기반의 라이브 영상에 적합합니다.

Abstract

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그린 형광 단백질 (GFP) timelapse 라이브 영상 그러한 조직 morphogenesis, 세포 - 세포 부착, 또는 세포 사망과 같은 동적 프로세스의 유전자 조절을 연구위한 강력한 기법입니다 기반. GFP를 표현 Drosophila의 배아는 즉시 중 입체 또는 공촛점 현미경을 사용하여 몇 군데 있습니다. 살아있는 영상 프로토콜의 목표는 탈수와 hypoxia로 해로운 영향을 최소화하는 것입니다. 라이브 영상 분석을위한 Drosophila의 배아를 준비 이전 프로토콜 할로 카본의 기름에 dechorionated 배아를 삽입하고 할로 카본 가스 투과 막과 coverslip 사이에 그들을 sandwiching 참여했습니다

Protocol

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준비

  1. 표준 포도 - 쥬스 한천 플레이트 4 배아를 수집합니다. 그것은 자동 Drosophila 에그 콜렉터 (Flymax 첨단 장비 회사)를 이용하시면 편리합니다. 동기를 사용하면 배아 컬렉션 원하는 발달 단계에서 배아의 충분한 숫자를 얻기 위해 수행되어야합니다 dechorionations의 수를 줄일 수 있습니다 개최.
  2. 현미경 슬라이드에 양면 테이프의 조각을 부착하여 dechorionation 슬라이드를 준비하며 테이프에서지지를 제거합니다.
  3. 챔버의 잘 적응하기 위해 조직의 일부를 절단하여 라이브 영상 챔버를 준비합니다. 우물에 조직을 넣고 증류수로 젖었어.
  4. 1시 1분의 비율로 혼합 할로 카본 오일 (할로 카본 제품 주식 회사) 점도 시리즈 700 및 시리즈 56. 혼합물은 저장하고 무기한 사용할 수 있습니다.
  5. coverslip (22 X 40mm, 제 2)의 표면에 할로 카본 오일의 여러 작은 방울을 넣으십시오. 볼륨 중요한 것은 아니지만 20-40 μl의 순서에 있어야합니다.

절차

  1. stereomicroscope의 도움으로 중 보석의 포셉 한 쌍의 (제 5) 또는 아주 좋은 페인트 브러쉬를 사용하여....

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Discussion

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우리는 우리가 매달려 드롭 프로토콜을 호출 라이브 영상 분석에 대한 Drosophila의 배아를 준비하는 새로운 방법을 설명합니다. 불행히도, 거꾸로 현미경으로 작업하는 경우 매달려 놓기 프로토콜을 사용하는 것은 불가능합니다. 이 경우에는 sandwiching 기술은 (같은 추상적 위에서 설명한) 사용하고 배아의 압축 우려 남아 있어야합니다.

세포 모양과 크기가 morphogenetic 운동과 관련된 세력을 계산하기 위해 측정 실험에서, 똑바로 현미경 및 매달려 드롭 프로토콜의 사용은 감소 배아 압축 것이 바람직 때문에입니다. 또한, 매달려 드롭 프로토콜을 사용하여 감소 배아 압축 sandwiching 기술이 평평 표면을 제시 반면 배아의 둥근 undistorted 표면을 표현의 결과가 있습니다. 공촛점 현미경을 사용하면 그것이 수집 그러므로 필요한 sandwiching 방법 대 매달려 드롭 프로토콜을 사용하는 경우 (스택 당 조각) 광범위한 Z - 스택. Z - 스택 당 조.......

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Acknowledgements

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우리는 기꺼이 디스커버리 그랜트뿐 아니라 연구 도구 및 자연 과학, 캐나다 공학 연구 협의회 (NSERC)에서 악기 부여를 통해 BHR 지원을 인정합니다. 또한 H.오다와 예제 라이브 영상 시퀀스에 사용되었습니다 유전 주식을 제공하는 블루밍턴 Drosophila 주식 센터를 인정합니다.

....

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Materials

현미경 슬라이드, coverslips (22 X 40mm, 번호 2), 양면 테이프, 보석의 포셉 (더몬트 스타일 번호 5 : 표준 장비 및 매달려 드롭 프로토콜을 사용하여 라이브 영상을위한 배아를 준비하는 데 필요한 자료는 다음과 같은 항목을 포함 ), 할로 카본 오일 시리즈 56 및 시리즈 700 (할로 카본 제품 주식 회사), 유틸리티 나이프 단일 에지 면도날, 조직 종이, 가위, 증류수, 범용 테이프, 그리고 20-40 μl를 전달하기위한 적합한 pipet. 라이브 영상 프로토콜은 또한 사용자 정의 만든 라이브 영상 챔버가 필요합니다. 이것은 5mm가 표준 현미경 슬라이드 (75 X 25mm)의 크기에 폴리 카보 네이트 플라스틱 시트를 생각 절단 및 슬라이드 (20 X 55mm)에 3mm 깊은 우울증을 생성하기 위해 로터를 사용하여 준비가되어 있습니다. stereomicroscope (현미경을 해부) 및 광섬유 조명 소스도 필요에 액세스할 수 있습니다.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
  2. Schock, F., Perrimon, N. Cellular processes associated with germ band retracti....

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Hanging Drop ProtocolDrosophila EmbryosLive ImagingHalocarbon OilStereo MicroscopyFluorescence MicroscopyEmbryo CollectionDechorionationHumid ChamberCoverslip Mounting

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