חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal
Summary
בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה שבאמצעותה לנתח את המוח חוליות עוברי דג הזברה מתפתח לחיות ברזולוציה של תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. זה כולל את השיטה שבאמצעותה אנו מזריקים את העובר מתא בודד דג הזברה ולאחר מכן הר התמונה במוח המתפתח.
Abstract
בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את השיטה במעבדה שלנו פיתחה לנתח את צורת התא שינויים rearrangements נדרש לכופף ולקפל את המוח דג הזברה מתפתח (Gutzman et al, 2008). ניתוח כזה מאפשר הבנה חדשה של ביולוגיה של התא הבסיסי הדרוש לפיתוח של מבנה 3D של המוח החוליות, מגביר באופן משמעותי את היכולת שלנו ללמוד המורפוגנזה בצינור העצבי. המוח העוברי היא בצורת דג הזברה החל הפריה 18 שעות שלאחר (hpf) כמו החדרים בתוך neuroepithelium לנפח. עד hpf 24, השלבים הראשונים של המורפוגנזה בצינור העצבי הושלמו. באמצעות השיטה המתוארת כאן, עוברים בשלב מסוים התא מוזרקים עם קידוד mRNA קרום במיקוד חלבון פלואורסצנטי ירוק (memGFP). לאחר hpf הזרקת הדגירה, העובר, בין 18 ל 24 עכשיו, הוא רכוב, הפוך, ב agarose הדמיה על ידי מיקרוסקופיה confocal. יש לציין כי העובר דג הזברה שקוף שהופך אותו אידיאלי עבור מערכת דימות פלואורסצנטי. בעוד ניתוחים שלנו התמקדו גבול למוח האחורי, המוח התיכון לבין למוח האחורי, שיטה זו ניתן יהיה להרחיב לניתוח האזור כל דג הזברה עד לעומק של 8-10 מיקרומטר.
Protocol
Discussion
בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה הזרקת mRNA עוברי דג הזברה לתוך תא בודד. כאן, אנו משתמשים mRNA קידוד GFP קרום במיקוד לתייג כל תא. לאחר מכן, אנו מדגימים כיצד הר התמונה במוח המתפתח ברזולוציה של תא בודד. טכניקה זו אפשרה לנו ללמוד סוג חדש של שינוי צורת התא, ההתכווצות הבזליים, נדרש היו?…
Acknowledgements
תודה רבה ד"ר ג'ניפר Gutzman מי הראשון שפותח את הטכניקה הזו במעבדה אלימה. תודה גם JB גרין בבית דנה פרבר סרטן המכון בבוסטון, מסצ'וסטס, אשר חביב סיפק את הקידוד פלסמיד CAAX-GFP-mRNA. הדמיה confocal נערך במתקן קק WM ביולוגית הדמיה הקרן ב וייטהד. HS נתמכת על ידי NIHMH70926. EG הוא נתמך על ידי מענק NSF מראש דוקטורט.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SeaKem GTG agarose | Reagent | Lonza | 50027 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Capillary tubing | Tool | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm |
| Silicone vacuum grease | Reagent | VWR | W0S717 | |
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11232-20 | Dumont #5 Bio Inox |
| 1-200 μl Pipette tips | Tool | Tip One, US Scientific | 111-0806 | These are the correct size for 24 hpf embryos. |
| mMessage mMachine transcription kit | Reagent | Ambion | AM1340 | SP6 RNA polymerase |
| Zeiss LSM 510 scanning confocal | Microscope | Zeiss | ||
| Micromanipulator | Tool | Narishige | ||
| Microinjector | Tool | Medical Systems Research Products Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Micropipette puller | Tool | Sutter Instruments |
References
- Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (1995).
