Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा Zebrafish भ्रूण मस्तिष्क की इमेजिंग लाइव
Summary
इस वीडियो में, हम एक विधि जिसके द्वारा confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा एकल कक्ष संकल्प पर रहते zebrafish भ्रूण में विकसित हड्डीवाला मस्तिष्क का विश्लेषण करने के लिए प्रदर्शित करता है. यह विधि है जिसके द्वारा हम zebrafish एकल कोशिका भ्रूण इंजेक्षन और बाद में माउंट और छवि विकासशील मस्तिष्क भी शामिल है.
Abstract
इस वीडियो में, हम हमारी प्रयोगशाला विधि सेल आकार में परिवर्तन और rearrangements मोड़ और विकासशील zebrafish मस्तिष्क (Gutzman एट अल, 2008) गुना करने की आवश्यकता का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया है प्रदर्शित करता है. इस तरह के विश्लेषण अंतर्निहित कक्ष हड्डीवाला मस्तिष्क के 3D संरचना के विकास के लिए आवश्यक जीव विज्ञान की एक नई समझ देता है, और काफी हमारे न्यूरल ट्यूब morphogenesis अध्ययन करने की क्षमता बढ़ जाती है. भ्रूण zebrafish मस्तिष्क neuroepithelium बढ़ भीतर निलय के रूप में 18 घंटे पोस्ट निषेचन (HPF) पर शुरुआत करने के लिए आकार का है. 24 HPF करके, न्यूरल ट्यूब morphogenesis के प्रारंभिक चरणों को पूरा कर रहे हैं. पद्धति का उपयोग करके यहाँ वर्णित है, एक सेल स्तर पर भ्रूण mRNA एन्कोडिंग झिल्ली लक्षित हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (memGFP) के साथ अंतःक्षिप्त रहे हैं. घुड़सवार, इंजेक्शन और ऊष्मायन, भ्रूण, 18 और 24 के बीच अब HPF के बाद, है उलटा, agarose में और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged. विशेष रूप से, zebrafish भ्रूण पारदर्शी है यह फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए एक आदर्श प्रणाली बनाने. जबकि हमारे विश्लेषण सीमा midbrain hindbrain और hindbrain पर ध्यान केंद्रित किया है, इस विधि 80-100 सुक्ष्ममापी की गहराई zebrafish में किसी भी क्षेत्र के विश्लेषण के लिए बढ़ाया जा सकता है.
Protocol
Discussion
इस वीडियो में, हम एकल कक्ष zebrafish भ्रूण में mRNA इंजेक्शन के लिए एक विधि का प्रदर्शन. यहाँ, हम एक झिल्ली लक्षित करने के लिए प्रत्येक कक्ष लेबल GFP mRNA एन्कोडिंग का उपयोग करें. हम तो प्रदर्शित कैसे माउंट करने के लिए …
Acknowledgements
डॉ. जेनिफर Gutzman जो पहले sive प्रयोगशाला में इस तकनीक विकसित करने के लिए बहुत धन्यवाद. दाना-Farber कैंसर संस्थान बोस्टन, MA, जो कृपया प्लाज्मिड एन्कोडिंग CAAX – GFP mRNA प्रदान पर भी जेबी ग्रीन धन्यवाद. confocal इमेजिंग WM उबकना फाउंडेशन जैव इमेजिंग सुविधा पर व्हाइटहेड में आयोजित किया गया. एच एस NIHMH70926 द्वारा समर्थित है. उदाहरण के एक NSF पूर्व डॉक्टरेट फैलोशिप द्वारा समर्थित है.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SeaKem GTG agarose | Reagent | Lonza | 50027 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Capillary tubing | Tool | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm |
| Silicone vacuum grease | Reagent | VWR | W0S717 | |
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11232-20 | Dumont #5 Bio Inox |
| 1-200 μl Pipette tips | Tool | Tip One, US Scientific | 111-0806 | These are the correct size for 24 hpf embryos. |
| mMessage mMachine transcription kit | Reagent | Ambion | AM1340 | SP6 RNA polymerase |
| Zeiss LSM 510 scanning confocal | Microscope | Zeiss | ||
| Micromanipulator | Tool | Narishige | ||
| Microinjector | Tool | Medical Systems Research Products Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Micropipette puller | Tool | Sutter Instruments |
References
- Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (1995).
