Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie
Summary
In diesem Video zeigen wir eine Methode, mit der sich entwickelnden Gehirn Wirbeltiere in Live Zebrafischembryonen bei einzelnen Zelle Auflösung durch konfokale Mikroskopie zu analysieren. Dazu gehört auch die Methode, mit der wir spritzen die Single-Cell-Zebrafischembryo und anschließend montieren und Bild das sich entwickelnde Gehirn.
Abstract
In diesem Video zeigen wir die Methode unserem Labor entwickelt, um die Zellform Änderungen und Umstellungen erforderlich zu biegen und falten Sie die Entwicklung von Zebrafisch Gehirn (Gutzman et al, 2008) analysiert hat. Eine solche Analyse bietet ein neues Verständnis der zugrunde liegenden Zellbiologie für die Entwicklung der 3D-Struktur von Gehirn der Wirbeltiere erforderlich und erhöht unsere Fähigkeit, Neuralrohr Morphogenese zu studieren. Die embryonalen Zebrafisch Gehirn ist so geformt, Beginn 18 Stunden nach der Befruchtung (HPF) als die Ventrikel im Neuroepithel aufzublasen. Bis zum 24. hpf, sind die ersten Schritte von Neuralrohrdefekten Morphogenese abgeschlossen. Mit der hier beschriebenen Methode, werden Embryonen auf der einen Zell-Stadium mit mRNA Membran gezielte grün fluoreszierende Protein (memGFP) injiziert. Nach der Injektion und Inkubation des Embryos, die jetzt zwischen 18 und 24 HPF, montiert ist, invertiert, in Agarose und abgebildet durch konfokale Mikroskopie. Bemerkenswert ist, dass der Zebrafisch-Embryos transparent machen ihn zu einem idealen System für Fluoreszenz-Bildgebung. Während unsere Analysen auf das Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze und die Hinterhirn konzentriert haben, könnte diese Methode für die Analyse von jeder beliebigen Region der Zebrafisch zu einer Tiefe von 80-100 mu m verlängert werden.
Protocol
Discussion
In diesem Video zeigen wir eine Methode zur mRNA-Injektion in einzelne Zelle Zebrabärblinge. Hier verwenden wir mRNA eine Membran gezielte GFP zu jeder Zelle Label. Wir haben dann gezeigt, wie die Montage und Bild das sich entwickelnde Gehirn in einzelnen Zelle Auflösung. Diese Technik hat uns erlaubt, eine neue Art von Zelle Form zu ändern, basale Einschnürung, für die Bildung der Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze (Gutzman et al, 2008) erforderlich studieren. Ähnliche Analyse von anderen Phänomenen hat das Potenzial,…
Acknowledgements
Vielen Dank an Dr. Jennifer Gutzman, die als erste entwickelt diese Technik in der Sive Labor. Danke auch an JB Green am Dana-Farber Cancer Institute Boston, MA, die uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt das Plasmid kodiert CAAX-GFP mRNA. Die konfokale Bildgebung wurde an der WM Keck Foundation Biological Imaging Facility am Whitehead durchgeführt. HS wird durch NIHMH70926 unterstützt. EG wird durch einen NSF pre-Stipendium unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SeaKem GTG agarose | Reagent | Lonza | 50027 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Capillary tubing | Tool | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm |
| Silicone vacuum grease | Reagent | VWR | W0S717 | |
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11232-20 | Dumont #5 Bio Inox |
| 1-200 μl Pipette tips | Tool | Tip One, US Scientific | 111-0806 | These are the correct size for 24 hpf embryos. |
| mMessage mMachine transcription kit | Reagent | Ambion | AM1340 | SP6 RNA polymerase |
| Zeiss LSM 510 scanning confocal | Microscope | Zeiss | ||
| Micromanipulator | Tool | Narishige | ||
| Microinjector | Tool | Medical Systems Research Products Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Micropipette puller | Tool | Sutter Instruments |
References
- Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (1995).
