Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale
Summary
In questo video, si dimostra un metodo con cui analizzare il cervello dei vertebrati sviluppo in embrioni di zebrafish dal vivo a una risoluzione singola cellula al microscopio confocale. Questo include il metodo con cui iniettare il unicellulare zebrafish e, successivamente, montare e immagine lo sviluppo del cervello.
Abstract
In questo video, dimostriamo il metodo nostro laboratorio ha sviluppato per analizzare i cambiamenti delle cellule forma e riarrangiamenti necessari per piegare e ripiegare il cervello pesce zebra di sviluppo (Gutzman et al, 2008). Tale analisi offre una nuova comprensione della biologia cellulare di base necessari per lo sviluppo della struttura 3D del cervello dei vertebrati, e aumenta notevolmente la nostra capacità di studiare la morfogenesi del tubo neurale. Il cervello ha la forma embrionale di zebrafish con inizio alle 18 ore dopo la fecondazione (HPF), come i ventricoli all'interno del neuroepitelio gonfiare. Da 24 HPF, i passi iniziali della morfogenesi del tubo neurale sono completi. Utilizzando il metodo descritto qui, gli embrioni allo stadio di una cellula sono iniettati con mRNA codifica membrana mirati proteina verde fluorescente (memGFP). Dopo l'iniezione e l'incubazione, l'embrione, ormai tra i 18 ei 24 HPF, è montato, capovolta, in agarosio e fotografato al microscopio confocale. In particolare, l'embrione di zebrafish è trasparente che lo rende un sistema ideale per l'imaging a fluorescenza. Mentre le nostre analisi si sono concentrate sul mesencefalo e il romboencefalo confine romboencefalo, questo metodo potrebbe essere esteso per l'analisi di qualsiasi altra regione del zebrafish ad una profondità di 80-100 micron.
Protocol
Discussion
In questo video, si dimostra un metodo per iniezione di mRNA in embrioni di zebrafish singola cellula. Qui, usiamo mRNA codifica una membrana mirati GFP di etichettare ogni cella. Abbiamo poi dimostrare come montare e immagine lo sviluppo del cervello a risoluzione singola cellula. Questa tecnica ci ha permesso di studiare un nuovo tipo di cella di cambiare forma, costrizione basale, necessari per la formazione del mesencefalo-romboencefalo confine (Gutzman et al, 2008). Un'analisi simile di altri fenomeni ha il pot…
Acknowledgements
Molte grazie a Dr. Jennifer Gutzman che per primo ha sviluppato questa tecnica in laboratorio Sive. Grazie anche a JB Verde presso il Dana-Farber Cancer Institute di Boston, MA che ha gentilmente fornito la codifica plasmide CAAX GFP-mRNA. L'imaging confocale è stato condotto presso il WM Keck Foundation Imaging Fondo Biologiche presso l'Whitehead. HS è supportato da NIHMH70926. EG è supportato da un pre-dottorato NSF.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SeaKem GTG agarose | Reagent | Lonza | 50027 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Capillary tubing | Tool | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm |
| Silicone vacuum grease | Reagent | VWR | W0S717 | |
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11232-20 | Dumont #5 Bio Inox |
| 1-200 μl Pipette tips | Tool | Tip One, US Scientific | 111-0806 | These are the correct size for 24 hpf embryos. |
| mMessage mMachine transcription kit | Reagent | Ambion | AM1340 | SP6 RNA polymerase |
| Zeiss LSM 510 scanning confocal | Microscope | Zeiss | ||
| Micromanipulator | Tool | Narishige | ||
| Microinjector | Tool | Medical Systems Research Products Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Micropipette puller | Tool | Sutter Instruments |
References
- Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (1995).
