Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı
Summary
Bu videoda, biz gelişmekte olan omurgalı beyin konfokal mikroskobu ile tek bir hücre çözünürlükte canlı zebrafish embriyolar analiz edildiği bir yöntem gösteriyor. Bu, tek hücreli zebrafish embriyo enjekte ve daha sonra gelişmekte olan beyin montaj ve görüntü hangi yöntemi içerir.
Abstract
Bu video, laboratuarımızda, gelişmekte olan zebrafish beyin (Gutzman ve ark, 2008) viraj ve katlama için gerekli hücre şekli değişiklikleri ve düzenlenmeleri analiz etmek için geliştirdiği yöntem göstermektedir. Böyle bir analiz, omurgalı beynin 3 boyutlu yapısının gelişimi için gerekli olan temel hücre biyolojisi yeni bir anlayış tanıyor ve nöral tüp morfolojilerinden çalışma yeteneğini önemli ölçüde artırır. Embriyonik zebrafish beyin 18 saat sonra döllenme (hpf) başlayarak neuroepithelium şişirmek içinde ventriküller olarak şekillenir. 24 hpf, nöral tüp morfolojilerinden ilk adımları tamamlamalısınız. Burada anlatılan yöntemi kullanarak, bir hücre aşamada embriyo mRNA kodlama membran hedefli yeşil flüoresan protein (memGFP) ile enjekte edilir. Enjeksiyon ve inkübasyonu, embriyo, şimdi 18 ve 24 arasında hpf sonra, agaroz, ters, monte edilir ve konfokal mikroskobu ile görüntülenmiş. Özellikle, floresan görüntüleme için ideal bir sistem haline zebrafish embriyo şeffaftır. Analizler, orta beyin Beyin sınır ve arka beyin odaklanmış olmasına rağmen, bu yöntem 80-100 mikron derinliğe kadar zebrafish herhangi bir bölge analizi için genişletilmiş olabilir.
Protocol
Discussion
Bu video, tek bir hücrenin zebrafish embriyolar içine mRNA enjeksiyon için bir yöntem ortaya koymaktadır. Burada, her bir hücre etiket için bir zar-hedefli GFP kodlayan mRNA kullanın. Daha sonra tek bir hücre çözünürlükte gelişmekte olan beyin nasıl montaj ve görüntü göstermektedir. Bu teknik bize hücre şekil değişikliği, orta beyin arka beyin sınır formasyonu (Gutzman ve ark, 2008) için gerekli olan bir roman türü, bazal daralma çalışmak için izin verdi. Benzer diğer olayların analiz…
Acknowledgements
Sive laboratuvarda ilk kez bu tekniği geliştirdi Dr. Jennifer Gutzman çok teşekkür ederiz. Lütfen plazmid kodlama CAAX-GFP mRNA sağlanan Dana-Farber Kanser Enstitüsü Boston, MA de JB Green teşekkür ederiz. Konfokal görüntüleme Whitehead WM Keck Vakfı Biyolojik Görüntüleme Tesisleri'nde gerçekleştirildi. HS NIHMH70926 tarafından desteklenmektedir. EG, bir NSF öncesi doktora bursu ile desteklenmektedir.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SeaKem GTG agarose | Reagent | Lonza | 50027 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Capillary tubing | Tool | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm |
| Silicone vacuum grease | Reagent | VWR | W0S717 | |
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11232-20 | Dumont #5 Bio Inox |
| 1-200 μl Pipette tips | Tool | Tip One, US Scientific | 111-0806 | These are the correct size for 24 hpf embryos. |
| mMessage mMachine transcription kit | Reagent | Ambion | AM1340 | SP6 RNA polymerase |
| Zeiss LSM 510 scanning confocal | Microscope | Zeiss | ||
| Micromanipulator | Tool | Narishige | ||
| Microinjector | Tool | Medical Systems Research Products Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Micropipette puller | Tool | Sutter Instruments |
References
- Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (1995).
