Após a formação do tubo neural, o neuroepitélio contrai e dobras, enquanto o tubo se enche de líquido cefalorraquidiano embrionárias (eCSF) para formar os ventrículos do cérebro embrionário. Nós desenvolvemos esta técnica de injeção do ventrículo para visualizar melhor o espaço cheio de líquido, em contraste com a forma neuroepiteliais em um embrião vivo.
Abstract
Formação adequada do ventrículo do cérebro durante o desenvolvimento embrionário do cérebro é necessário para a função cerebral normal. Ventrículos cerebrais são as cavidades altamente conservadas dentro do cérebro que são preenchidos com fluido cerebrospinal. Em peixes-zebra, após a formação do tubo neural, o neuroepitélio sofre uma série de constrições e dobras, enquanto ele se enche de fluido, resultando na formação de ventrículo cerebral. A fim de compreender o processo de formação do ventrículo, e as mudanças que ocorrem neuroepiteliais forma, ao mesmo tempo, precisávamos de uma forma de visualizar o espaço do ventrículo em comparação com o tecido cerebral. No entanto, a natureza de embriões zebrafish transparente torna difícil diferenciar o tecido do espaço ventrículo. Por isso, desenvolvemos uma técnica de injeção ventrículo cerebral onde o espaço de ventrículo é preenchido com um corante fluorescente e fotografada pela claro e microscopia de fluorescência. O claro e as imagens fluorescentes são então processadas e sobrepostos no Photoshop. Esta técnica permite a visualização do espaço do ventrículo com o corante fluorescente, em comparação com a forma do neuroepitélio na imagem de campo claro. Injeção cérebro ventrículo no peixe-zebra pode ser empregado a partir de 18 horas após a fecundação até o início fases larval. Temos utilizado esta técnica extensivamente em nossos estudos de formação do cérebro do ventrículo e morfogênese, bem como na caracterização de mutantes cérebro morfogênese (1-3).
Protocol
Protocolo Parte 1: Preparando-se para microinjeção Prepare-se para a injeção puxando agulhas capilar utilizando Sutter extrator de agulhas Instruments. Preencha a agulha com um corante fluorescente (como Texas Red-Dextran). Montar a agulha em um aparelho de microinjeção e micromanipulador. Cortar a agulha para o tamanho apropriado em um ângulo para criar uma ponta chanfrada. Medir o tamanho de gota e verifique se ele está entre 1-2nl po…
Discussion
Neste vídeo demonstramos como injetar corante fluorescente (Texas-Red Dextran) no desenvolvimento de ventrículos cerebrais zebrafish. Este método é usado para visualizar o espaço do ventrículo cerebral em contraste com a neuroepitélio circundante e é extremamente útil para determinar a forma do espaço ventrículo, bem como a forma do tecido cerebral circundante. Ela nos permite compreender melhor o processo de formação do cérebro e morfogênese do ventrículo cerebral ao longo do tempo no embrião vivo. Est…
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Laura Anne Lowery, que desenvolveu essa técnica no laboratório. HS é suportada por NIHMH70926. Jennifer Gutzman foi apoiado pelo companheirismo CSBI / Merck pós-doutorado.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Forceps
Tool
Fine Science Tools
11252-20
Capillary Tubes (needles)
Tools
Frederick Haer and Co.
30-30-1
Agarose-Coated dishes
Tools
Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning)
Agarose (50027) Dishes (430166)
Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting
Dissecting Microscope
Microscope
Zeiss Stereomicroscope Stemi SV 6
Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software
Tools
1-200 μ pipette tips
Tools
Tip One, US Scientific
1111-0806
These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly.
Photoshop
Image Analysis
Adobe
Embryo Loop
Tools
Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax.
Microinjector
Tools
Medical Systems Research Products Harvard Apparatus
PL1-100
Needle Puller
Tools
Sutter Instruments
Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70).