Zebravis hele Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridisatie

Summary

Hele monteren in situ hybridisatie is een van de meest gebruikte technieken in de ontwikkelingsbiologie. Hier presenteren wij een hoge resolutie dubbele fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de analyse van de precieze expressiepatroon van een enkel gen en voor het bepalen van de overlap van de expressie-domeinen van twee genen. We nemen een propidiumjodide nucleair anti-vlek weefsel organisatie te markeren.

Abstract

Whole mount<em> In situ</em> Hybridisatie is een van de meest gebruikte technieken in de ontwikkelingsbiologie. Hier presenteren wij een hoge resolutie dubbele tl<em> In situ</em> Hybridisatie protocol voor de analyse van de precieze expressiepatroon van een enkel gen en voor het bepalen van de overlap van de expressie-domeinen van twee genen. Het protocol is een aangepaste versie van de standaard<em> In situ</em> Hybridisatie met behulp van alkalische fosfatase en substraten zoals NBT / BCIP en snelle Red^1,2. Dit protocol maakt gebruik van standaard digoxygenin en fluoresceïne gelabelde probes, samen met tyramide signaalversterking (TSA)³. De commercieel verkrijgbare TSA kits maken een flexibele opzet van het experiment fluorescentie-emissie van groen naar ver-rood kan worden gebruikt in combinatie met diverse nucleaire vlekken, zoals propidiumjodide, of fluorescentie immunohistochemie voor eiwitten. TSA produceert een reactieve fluorescent substraat die snel covalent bindt aan groepen, meestal tyrosine residuen, in de directe omgeving van de gelabelde antisense riboprobe. De resulterende kleurpatronen zijn hoge resolutie in die subcellulaire lokalisatie van het mRNA kan worden waargenomen met behulp van laser scanning confocale microscopie^3,4. Men kan waarnemen ontluikende transcripten in de chromosomale loci, onderscheiden nucleaire en cytoplasmatische kleuring en visualiseren andere patronen, zoals corticale lokalisatie van mRNA. Studies in<em> Drosophila</em> Geven aan dat ongeveer 70% van de mRNA's specifieke patronen van de subcellulaire lokalisatie die vaak samenhangen met de functie van het gecodeerde eiwit vertonen⁵. In combinatie met computer-aided reconstructie van 3D-confocale datasets, ons protocol maakt een gedetailleerde analyse van mRNA distributie met sub-cellulaire resolutie in zijn geheel gewervelde embryo's.

Protocol

1. FIXATION Fix embryo's overnacht bij 4 ° C met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS. Verwijder de fix en was 2 x PBS, 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Handmatig dechorionate embryo's in PBS in een glazen plaat met behulp van depressie horlogemaker tang. Na dechorionation, worden embryo's met behulp van een brand-gepolijst glas Pasteur pipet omdat ze kunnen blijven plakken aan polypropyleen pipetten. Overdracht van embryo's door middel van een serie van 25%, 50%…

Discussion

Het protocol hier gepresenteerde werkt goed met probes die een schone sterk signaal te geven na kleuring voor 30-45 minuten in een typisch alkalische fosfatase-gemedieerde reactie. Voorafgaand aan het uitvoeren van de fluorescente in situ hybridisatie protocol, we altijd testen onze sondes met behulp van de standaard niet-fluorescerende protocol (voorzien in aanvullende materiaal, samen met de sonde synthese-protocol). We hebben minder succes met de fluorescente in situ hybridisatie protocol bij het gebruik van zwakkere…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade		Electron Microscopy Services	15710	Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C
Proteinase K, recombinant PCR grade		Roche	03115879001	Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C
Blocking Reagent		Roche	11096176001	Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws.
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments		Roche	11426346910	Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C.
Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments		Roche	11207739910	As above.
TSA Plus Fluorescein system		Perkin Elmer	NEL741001KT	Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C.
TSA Plus Cyanine5 system		Perkin Elmer	NEL745001KT	As above
TSA Plus Cyanine3 system		Perkin Elmer	NEL744001KT	As above
TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG)		Molecular Probes /Invitrogen	T20926	Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C.
RNase, DNase free		Roche	11119915001	Supplied as 500μg/ml solution
Propidium Iodide		Molecular Probes /Invitrogen	P-3566	Supplied as 1mg/ml solution in water.