Method Article

렌즈 Zebrafish의 이식과 눈 돌연변이의 분석에의 응용

DOI:

10.3791/1258

⸱

June 1st, 2009

 ,  , 
1The Second Teaching Hospital of Jilin University, 2Department of Ophthalmology, Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

렌즈 개발은 다른 조직과 상호 작용을 포함한다. 여러 zebrafish 아이 돌연변이 비정상적으로 작은 렌즈의 크기가 특징입니다. 여기 우리는이 표현형은 본질적 원인이나 렌즈를 둘러싸고있는 조직과 결함이 상호 작용에 의한 있는지 여부를 확인하기 위해 렌즈 이식 실험을 보여줍니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

렌즈는 광학 컵 [1,2]의 개발에 중요한 역할을합니다. 모델 유기체로 zebrafish를 사용하여 렌즈 개발에 관한 질문은 해결할 수 있습니다. zebrafish 작은 크기, 높은 생산력, 짧은 수명주기, 그리고 관리의 용이성 등 여러 가지 유리한 특성에 의한 유전자 연구에 유용합니다. 렌즈 개발 zebrafish에 급속하게 발생합니다. 72 HPF으로 zebrafish 렌즈 기능 성숙이다 [3]. 풍부한 유전 및 분자 자원 zebrafish 연구를 지원하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, 다른 척추 동물들에게 zebrafish 눈의 유사성은 인간의 결함이 뛰어난 동물 모델 [4-7]과 같이 사용에 대한 기초를 제공합니다. 여러 zebrafish의 돌연변이가 어떤 경우에는 렌즈 조직의 완전한 변성에 이르게 세포 사망의 높은 수준 [8]. 포함한 렌즈 이상 전시

렌즈 이상은 본질적인 원인이나 주변 조직과 결함이 상호 작용에 의한인지 확인하려면, 야생 형 안구에 돌연변이 렌즈의 이식이 수행됩니다. 를 사용하여 화재를 광택 금속 바늘, 돌연변이 또는 야생 형 렌즈는 신중하게 기증 동물의 해부를하고, 호스트로 전송됩니다. 야생 타입과 돌연변이 조직을 구분하기 위해 유전자 변형 라인은 기증자로 사용됩니다. 이 줄은 렌즈를 포함한 모든 조직의 막 - 바운드 GFP를 표현합니다. 이 이식 기술은 zebrafish 렌즈 돌연변이의 연구에 필수적인 도구입니다.

Protocol

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1 부 : 배아 준비

이 프로토콜에서는, 우리는 가상 zebrafish 렌즈 돌연변이 거하고 있음을 나타내는 JJ XY 기호를 사용합니다.

  1. Zebrafish의 변종은 14h light/10h 어두운주기 28.5 C에서 표준 생선 시설 조건에서 유지됩니다.
  2. 저녁에는 자리 남성과 zebrafish 변형 JJ XY의 여성 : AB / TU, 서로를 구분하는 구분선과 탱크에 TG (mGFP). 이 십자가의 자손은 모든 조직에서 GFP의 transgene을 표현되며, 기부자로 사용됩니다. 병렬로, 비 - 유전자 변형 야생 형 동물 사이의 경계를 설정하는 동일한 절차를 사용합니다. 본 실험의 목적에 따라, 한 기증자 또는 호스트로 JJ XY의 로커스에서 야생 타입 동물을 교차 수 있습니다.
  3. 빛이 아침에 켜지 후 한 시간 이내, 친구에게 물고기를 허용하도록 디바이더를 제거합니다.
  4. 15-30분 100 X 15mm 배양 접시에 배아를 수집 후, 그들을 청소하고, 매체 (계란 물)을 변경합니다.
  5. 원하는 시간까지 28.5 C 배양기에서 배아 보관하....

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Discussion

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여러 단계 렌즈 transplantations 중 특별한주의가 필요합니다.

  1. 바늘을 날카롭게 : 그것은 렌즈 이식을 수행하기 전에 몇 가지 바늘을 준비하는 것이 좋습니다, 그리고 바늘 끝이 가능한 얇은해야합니다. 두꺼운 바늘은 치료 눈에 실패를 초래하기 때문에 넓은 직경이 더 많은 조직을 찢어 것입니다.
  2. 배아를 정리 : 그들의 측면에 누워되도록 마우스 이식하기 전에 배아를 위치합니다. 위치하면, 1.2 % 아가로 오스는 강화는 매우 신속하게하실 수 있습니다. 아가로 오스의 경화 속도가 느린하려면, 페트리 접시는 그것이 40 ° C 물 욕조에서 부동 주어 preheated 수 있습니다.
  3. 호스트의 눈을 기증 렌즈를 삽입하기 전에 가능한 호스트 머리 주위에 많은 아가로 오스를 제거하려고합니다. 그것은 기증자 렌즈 그런식으로 삽입 쉽게.
  4. 그냥 렌즈 이식 후 배아가 0.2 % 아가로 오스 계층이 적용되는 1.2 % 아가로 오스 레이어에 포함된 남아 있어야합니다........

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Acknowledgements

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이 절차는 이식 기술은 빌 제프리의 실험실에 의해 동굴 물고기를 위해 개발된 광범위하게 따릅니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1mm 직경의 텅스텐 와이어A Johnson Matthey45086
Agarose(저융점)Sigma-Aldrich39346
붕규산 유리 모세관World Precision Instruments, Inc.TW 100-4
집게Dumont11252-30
파스퇴르 피펫Fisher Scientific13-678-20C
피펫 펌프Fisher Scientific13-683C
페트리 접시Cardinal HealthD1906
페니실린-스트렙토마이신GIBCO, Life Technologies15140-122

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev Biol. 231, 63-76 (2001).
  2. Yamamoto, Y., Jeffery, W. R.

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Lens TransplantationZebrafish ModelGFP ExpressionNeedle PreparationEmbryo DissectionTissue IsolationMutant AnalysisWild type HostPhenotypic ObservationAutonomous Function

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