Het meten van Plant Cell muur Extension (Creep) geïnduceerd door zure pH en door Alpha-Expansin

Summary

We demonstreren het gebruik van een constante kracht extensometer op lange termijn uitbreiding (kruip) van plantaardige celwand exemplaren veroorzaakt door zure buffers en expansin eiwitten te meten.

Abstract

Groeiende plant celwanden karakteristiek vertonen een eigenschap bekend als 'zuur groei', waarmee we bedoelen ze meer uitbreidbaar bij lage pH (<5) ^1. Het plantenhormoon auxine stimuleert snel celelongatie in jonge stengels en dergelijke weefsels ten minste gedeeltelijk door een zuur-groei-mechanisme ^{2, 3.} Auxine activeert een H ⁺ pomp in het plasmamembraan, waardoor verzuring van de celwand oplossing. Wand verzuring activeert expansins, die endogene celwand-losmaken eiwitten ^4, waardoor de celwand te geven aan de muur spanningen gecreëerd door cel turgor druk. Als gevolg hiervan, de cel snel begint te vergroten. Deze 'zuur groei' fenomeen is gemakkelijk gemeten in geïsoleerde (niet-levende) celwand exemplaren. Het vermogen van celwanden te zuur-geïnduceerde uitbreiding ondergaan, is niet simpelweg het gevolg van de structurele regeling van de celwand polysacchariden (bijvoorbeeld pectine), maar hangt af van de activiteit van expansins ^5. Expansins hebben geen bekend enzymatische activiteit en de enige manier om test voor expansin activiteit bestaat uit het meten hun inductie van celwand extensie. Deze video rapport beschrijft de bronnen en de voorbereiding van technieken voor het verkrijgen van geschikte materialen voor wand-expansin assays en gaat verder om aan te tonen zuur-geïnduceerde uitbreiding en expansin-geïnduceerde verlenging van de muur monsters bereid uit groeiende komkommer hypocotylen.

Voor het verkrijgen van geschikte celwand monsters, komkommer zaailingen worden geteeld in het donker, de hypocotylen worden gesneden en ingevroren bij -80 ° C. Frozen hypocotylen zijn afgesleten, afgeplat, en vervolgens geklemd bij een constante spanning in een speciale cuvet voor extensometer metingen. Voor het meten van zuur-geïnduceerde uitbreiding, zijn de muren in eerste instantie gebufferd bij een neutrale pH, wat resulteert in lage activiteit van expansins die zijn componenten van de inheemse celwanden. Bij buffer te wisselen om zure pH, zijn expansins geactiveerd en de celwanden te breiden snel. We hebben ook laten zien expansin activiteit in een reconstitutie test. Voor dit gedeelte maken we gebruik van een korte warmtebehandeling om de inheemse expansins in de celwand monsters denatureren. Deze geïnactiveerd celwanden zelfs niet uit te breiden in zure buffer, maar de toevoeging van expansins om de celwanden snel herstelt hun vermogen om uit te breiden.

Protocol

Deel 1: Groeien en opslaan van geschikt plantmateriaal In onze ervaring, jonge hypocotylen uit geëtioleerde komkommer zaailingen dienen als een handige bron van de celwand materiaal voor deze experimenten. Komkommer zaden worden gezaaid op nat papier in een lichtdichte doos, die in een donkere kast te houden in een constante temperatuur ruimte ingesteld op 26 ° C. De exacte temperatuur is niet kritisch, als iets tussen 22 ° en 30 ° C moet fijn, maar de temperatuur zal bepalen hoe snel de zaailingen een ju…

Discussion

Voor deze demonstratie hebben we celwanden gebruikt van komkommer hypocotylen, omdat ze hebben bewezen een betrouwbare bron van wand-monsters die zijn gemakkelijk te hanteren en die reageren met een goede gevoeligheid. We hebben ook een goede succes met muren van andere zaailingen evenals sommige materialen uit de supermarkt, zoals jonge spinazie bladeren en stengels bleekselderij. Kortom, jong, zacht, snel groeiende plant weefsels die waarschijnlijk gemakkelijk gemeten worden met deze techniek, maar taaie, oude, geoxid…