Messen pflanzlichen Zellwand Extension (Creep) durch saure pH-Wert und von Alpha-Expansin Induced

Summary

Wir zeigen die Verwendung eines konstanten Kraft Extensometer zur langfristigen Erweiterung (Kriechen) der pflanzlichen Zellwand Proben von sauren Puffern und expansin Protein induziert messen.

Abstract

Wachsende pflanzlichen Zellwände charakteristisch weisen eine Eigenschaft als "Säure Wachstum", mit denen wir meinen, sie sind mehr erweiterbare bei niedrigen pH-Wert (<5) ¹ bekannt. Das Pflanzenhormon Auxin schnell stimuliert Zellstreckung in jungen Stängel und ähnliche Gewebe zumindest teilweise durch eine Säure-Wachstums-Mechanismus ^{2, 3.} Auxin aktiviert eine H ^+-Pumpe in der Plasmamembran, Versauerung der Zellwand Lösung. Wand Versauerung aktiviert expansins, die endogene Zellwand-Lockerung Proteine ^​​4 sind, wodurch die Zellwand an der Wand Spannungen, die durch Zelle Turgor erstellt Ertrag. Als Folge beginnt die Zelle rasch vergrößern. Diese "acid Wachstum" Phänomen ist leicht in isolierten (unbelebten) Zellwand Proben gemessen. Die Fähigkeit der Zellwände zu Säure-induzierte Erweiterung unterzogen wird nicht einfach das Ergebnis der strukturellen Anordnung der Zellwand-Polysaccharide (zB Pektine), sondern hängt von der Aktivität der expansins ^5. Expansins haben noch keine bekannten enzymatischen Aktivität und der einzige Weg, um Assay für expansin Aktivität ist es, ihre Induktion von Zellwand-Erweiterung zu messen. Dieses Video Bericht beschreibt ausführlich die Quellen und die Vorbereitung Techniken zur Gewinnung von geeigneten Wandmaterialien für expansin Assays und fährt fort, Säure-induzierte Verlängerung und expansin-induzierte Verlängerung der Wand Proben aus wachsenden Gurke Hypokotylen vorbereitet zu zeigen.

Um geeignete Zellwand Proben, Gurkenkeimlingen im Dunkeln gezüchtet werden, die Hypokotyle geschnitten und bei -80 ° C eingefroren Gefrorene Hypokotylen abgetragen, abgeflacht, und dann bei konstanter Spannung in eine spezielle Küvette für Extensometer Messungen gespannt. Zur Messung säureinduzierte Erweiterung, die Wände sind zunächst im neutralen pH-gepuffert, so dass eine niedrige Aktivität der expansins, dass Komponenten des nativen Zellwände. Nach Puffer Austausch zu sauren pH-Wert, sind expansins aktiviert und die Zellwände zu verlängern schnell. Wir zeigen auch expansin Aktivität in einer Rekonstitution Assay. Für diesen Teil verwenden wir eine kurze Wärmebehandlung auf die native expansins in der Zellwand Proben zu denaturieren. Diese inaktivierten Zellwände nicht einmal verlängern in sauren Puffer, sondern zusätzlich von expansins die Zellwände schnell wieder ihre Fähigkeit, zu verlängern.

Protocol

Teil 1: Anbau und Lagerung geeignet Pflanzenmaterial Nach unserer Erfahrung dienen junge Hypokotylen aus etiolierten Gurkenkeimlingen als eine bequeme Quelle für Zellwandmaterial für diese Experimente. Gurken Samen werden auf feuchtem Papier in einer lichtdichten Box, die in einem abgedunkelten Schrank in einem Raum mit konstanter Temperatur bei 26 gesetzt ist ° C zu halten gesät Die genaue Temperatur ist nicht entscheidend, wie alles, was zwischen 22 ° und 30 ° C sollte in Ordnung sein, aber die Temper…

Discussion

Für diese Demonstration verwendeten wir Zellwände von Gurken Hypokotylen, weil sie sich als eine zuverlässige Quelle für Wand-Proben, die leicht zu handhaben und mit guter Empfindlichkeit reagieren werden müssen. Wir haben auch schon gute Erfolge mit Wänden aus anderen Keimlingen sowie einige Materialien aus dem Supermarkt, wie junge Spinatblätter und Stangensellerie. Grundsätzlich sind jung, weich, schnell wachsende Pflanzengewebe wahrscheinlich leicht mit dieser Technik gemessen werden, sondern harte, alte, ox…