Mätning Plant Cell Wall Extension (Creep) induceras av surt pH-värde och Alpha-Expansin

Summary

Vi visar användandet av en konstant kraft tensiometer att mäta långsiktiga förlängning (krypning) av vägg växtcell exemplar induceras av sura buffertar och expansin protein.

Abstract

Växande plantan cellväggar uppvisar karakteristiskt en fastighet som kallas "sura tillväxt", med vilket vi menar de är mer utbyggbar vid lågt pH (<5) ^1. Anläggningen hormonet auxin stimulerar snabbt cell förlängningen i unga stjälkar och liknande vävnader åtminstone delvis av en syra-tillväxt mekanism ^{2, 3.} Auxin aktiverar en H ⁺ pump i plasmamembranet, vilket leder till försurning av cellväggen lösningen. Wall försurning aktiverar expansins, som är endogena cellväggen-lossa proteiner ^4, vilket gör cellväggen att ge på väggen spänningar som skapas av cellen saftspänningen. Som ett resultat börjar cellen att förstora snabbt. Denna "sura tillväxt" Fenomenet är lätt mäts i isolerade (icke-levande) exemplar cellvägg. Förmåga cellväggar att genomgå sura-inducerad förlängning är inte bara ett resultat av den strukturella placeringen av polysackarider cellväggen (t.ex. pektiner), men beror på den aktivitet expansins ^5. Expansins inte har någon känd enzymatisk aktivitet och det enda sättet att assay för expansin verksamhet är att mäta deras induktion av cellvägg förlängning. Denna video rapport redovisar källor och tekniker förberedelse för att få ett passande väggmaterial för expansin analyser och fortsätter att visa sura-inducerad förlängning och expansin-inducerad förlängning av vägg prov som har beretts från att växa gurka hypocotyls.

För att få lämpliga prover cellväggen, gurka plantor odlas i mörker, är hypocotyls klippa och frysas vid -80 ° C. Frysta hypocotyls är skadad, stryks ut, och sedan spänns fast med konstant spänning i en speciell kyvett för tensiometer mätningar. För att mäta syra-inducerad förlängning, är väggarna initialt buffrade vid neutralt pH, vilket resulterar i låga aktivitet expansins som är delar av den infödda cellväggar. När bufferten utbyte till surt pH-värde, är expansins aktiveras och cellväggarna förlänga snabbt. Vi visar också expansin verksamhet i en beredning analys. För denna del använder vi en kort värmebehandling för att denaturera infödda expansins i cellväggen prover. Dessa inaktiverat cellväggar sträcker sig inte ens i sura buffert, men tillägg av expansins att cellväggarna snabbt återställer deras förmåga att förlänga.

Protocol

Del 1: Odling och lagring lämpligt växtmaterial Vår erfarenhet är att unga hypocotyls från etiolated gurka plantor tjäna som en bekväm källa cellvägg material för dessa experiment. Gurka frön sås på vått papper i en ljus-låda, som håller i ett mörkt skåp i en konstant temperatur rum inställd på 26 ° C. Den exakta temperaturen är inte kritisk, eftersom allt mellan 22 ° och 30 ° C ska vara bra, men temperaturen kommer att avgöra hur snabbt plantorna nå en lämplig utvecklingsstadium. J…

Discussion

För denna demonstration använde vi cellväggar från gurka hypocotyls eftersom de har visat sig vara en pålitlig källa för vägg prover som är lätta att hantera och som svarar med god känslighet. Vi har också haft god framgång med väggar från andra plantor samt en del material från stormarknaden, till exempel unga spenat blad och stjälkar selleri. I grund och botten, ung, mjukt, snabbt växande växt vävnader är troligt att de lätt mätas med denna teknik, men tuffa, äldre, oxiderade eller nongrowing p…