Dendra2 Photoswitching من خلال نافذة التصوير الثديية
Summary
photoswitching Intravital وتتبع Dendra2 المسمى الخلايا السرطانية من خلال نافذة الثديية التصوير هو الأسلوب الذي يسمح لنا صورة السلوك المنتشر من الخلايا السرطانية في الورم microenvironments اختيار أكثر من مقياس من الأيام.
Abstract
في العقد الماضي ، الفحص المجهري intravital من أورام الثدي في الفئران والجرذان وحيدة الخلية في القرار<sup> 1-4</supوقد أدى> في نظرات ثاقبة في آليات السلوك المنتشر مثل الغزو والهجرة وintravasation الخلايا السرطانية<sup> 5 ، 6</sup> ، الأوعية الدموية<sup> 3</sup> استجابة مناعية وخلايا<sup> 7-9</sup>. وقد أبلغنا مؤخرا تقنية لسرطان الثدي صورة مثلي على عدة دورات في التصوير intravital الفئران الحية<sup> 10</sup>. لذلك ، قمنا بتطوير إطار التصوير الثديية (MIW) والمعلمات التصوير الأمثل لDendra2<sup> 11</sup> photoswitching والتصوير<em> في الجسم الحي</em>. هنا ، نحن تصف البروتوكول لتصنيع MIW ، أو الإدراج من MIW على رأس الورم والتصوير من الخلايا السرطانية التي تحمل علامات Dendra2 باستخدام مربع مخصصة التصوير بناؤها. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لصورة السلوك المنتشر من الخلايا السرطانية في microenvironments متميزة في الأورام ، ويسمح للتصوير على المدى الطويل من الأوعية الدموية والخلايا السرطانية والخلايا المضيفة.
Protocol
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل وزارة الدفاع الأميركية (BG BC075554 لوBC061403 إلى DK) الأميركية ، والمعاهد الوطنية للصحة (U54GM064346 لJvR ؛ CA100324 إلى JC ، JES وJW ؛ CA77522 لJES ، U54CA126511 إلى JC وBG). نشكر دال Entenberg للحصول على مساعدة المجهري ، M. Rottenkolber للمساعدة في تصنيع مربع التصوير وياء بولارد (كلية ألبرت آينشتاين للطب) للأجسام المضادة F4/80.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PBS w/o Ca, Mg | Gibco | 14190-144 | ||
| Trypsin | Gibco | 25300 | ||
| HBSS | Gibco | 14025 | ||
| DMEM media (MDA-MB-231 cells) | Gibco | 11965 | ||
| Isoflurane(Aerrane) | Baxter | # NDC 10019-773-40 | ||
| SCID mouse | NCI | N/A | ||
| Culture dishes | BD Falcon | 353003 | Custom Order | |
| Circular coverslip 8 mm | Scientific, Inc. | 8CIR-1-FIS |
References
- Farina, K. L., Wyckoff, J. B., Rivera, J., Lee, H., Segall, J. E., Condeelis, J. S., Jones, J. G. Cell motility of tumor cells visualized in living intact primary tumors using green fluorescent protein. Cancer Res. 58, 2528-2532 (1998).
- Naumov, G. N., Wilson, S. M., MacDonald, I., Schmidt, E. E., Morris, V. L., Groom, A. C., Hoffman, R. M., Chambers, A. F. Cellular expression of green fluorescent protein, coupled with high-resolution in vivo videomicroscopy, to monitor steps in tumor metastasis. J Cell Sci. 112, 1835-1842 (1999).
- Brown, E. B. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Med. 7, 864-868 (2001).
- Wang, W., Wyckoff, J. B., Frohlich, V. C., Oleynikov, Y., Huttelmaier, S., Zavadil, J., Cermak, L., Bottinger, E. P., Singer, R. H., White, J. G., Segall, J. E., Condeelis, J. S. Single cell behavior in metastatic primary mammary tumors correlated with gene expression patterns revealed by molecular profiling. Cancer Res. 62, 6278-6288 (2002).
- Sidani, M., Wyckoff, J., Xue, C., Segall, J. E., Condeelis, J. Probing the microenvironment of mammary tumors using multiphoton microscopy. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 151-163 (2006).
- Wyckoff, J. B., Wang, Y., Lin, E. Y., Li, J. F., Goswami, S., Stanley, E. R., Segall, J. E., Pollard, J. W., Condeelis, J. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).
- Egeblad, M., Ewald, A. J., Askautrud, H. A., Truitt, M. L., Welm, B. E., Bainbridge, E., Peeters, G., Krummel, M. F., Werb, Z. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Adrian, U. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2604-2609 (2003).
- Kedrin, D., Gligorijevic, B., Wyckoff, J., Verkhusha, V. V., Condeelis, J., Segall, J. E., van Rheenen, J. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5, 1019-1021 (2008).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nat. Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
