Dendra2 Photoswitching attraverso la finestra Imaging mammaria
Summary
Photoswitching intravitale e tracking di Dendra2 marcato le cellule tumorali attraverso la finestra Imaging mammaria è una tecnica che ci permette di immagine il comportamento metastatico delle cellule tumorali in microambienti tumorali scelto su una scala temporale di giorni.
Abstract
Nell'ultimo decennio, la microscopia intravitale dei tumori al seno in topi e ratti a singola cella di risoluzione<sup> 1-4</sup> Ha portato a importanti conoscenze sui meccanismi di comportamento metastatico come la migrazione, invasione e intravasation delle cellule tumorali<sup> 5, 6</sup>, L'angiogenesi<sup> 3</sup> E la risposta immunitaria delle cellule<sup> 7-9</sup>. Abbiamo recentemente segnalato una tecnica di immagine ortotopico carcinomi mammari su più sessioni di imaging intravitale in topi vivi<sup> 10</sup>. Per questo, abbiamo sviluppato una finestra mammaria Imaging (MIW) e parametri di imaging ottimizzato per Dendra2<sup> 11</sup> Photoswitching e imaging<em> In vivo</em>. Qui, descriviamo il protocollo per la produzione di MIW, inserimento del MIW sulla cima di un tumore e imaging del Dendra2 marcato le cellule tumorali mediante una casella personalizzata di imaging costruito. Questo protocollo può essere usato per l'immagine del comportamento metastatico delle cellule tumorali in microambienti distinti in tumori e permette l'imaging a lungo termine dei vasi sanguigni, le cellule tumorali e cellule ospiti.
Protocol
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal US Department of Defense (BC075554 di BG e BC061403 a DK), US National Institutes of Health (U54GM064346 a JVR; CA100324 di JC, JES e JW; CA77522 di JES, U54CA126511 di JC e BG). Ringraziamo D. Entenberg aiuto per microscopia, M. Rottenkolber aiuto nella fabbricazione della scatola di imaging e J. Pollard (Albert Einstein College of Medicine) per l'anticorpo F4/80.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PBS w/o Ca, Mg | Gibco | 14190-144 | ||
| Trypsin | Gibco | 25300 | ||
| HBSS | Gibco | 14025 | ||
| DMEM media (MDA-MB-231 cells) | Gibco | 11965 | ||
| Isoflurane(Aerrane) | Baxter | # NDC 10019-773-40 | ||
| SCID mouse | NCI | N/A | ||
| Culture dishes | BD Falcon | 353003 | Custom Order | |
| Circular coverslip 8 mm | Scientific, Inc. | 8CIR-1-FIS |
References
- Farina, K. L., Wyckoff, J. B., Rivera, J., Lee, H., Segall, J. E., Condeelis, J. S., Jones, J. G. Cell motility of tumor cells visualized in living intact primary tumors using green fluorescent protein. Cancer Res. 58, 2528-2532 (1998).
- Naumov, G. N., Wilson, S. M., MacDonald, I., Schmidt, E. E., Morris, V. L., Groom, A. C., Hoffman, R. M., Chambers, A. F. Cellular expression of green fluorescent protein, coupled with high-resolution in vivo videomicroscopy, to monitor steps in tumor metastasis. J Cell Sci. 112, 1835-1842 (1999).
- Brown, E. B. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Med. 7, 864-868 (2001).
- Wang, W., Wyckoff, J. B., Frohlich, V. C., Oleynikov, Y., Huttelmaier, S., Zavadil, J., Cermak, L., Bottinger, E. P., Singer, R. H., White, J. G., Segall, J. E., Condeelis, J. S. Single cell behavior in metastatic primary mammary tumors correlated with gene expression patterns revealed by molecular profiling. Cancer Res. 62, 6278-6288 (2002).
- Sidani, M., Wyckoff, J., Xue, C., Segall, J. E., Condeelis, J. Probing the microenvironment of mammary tumors using multiphoton microscopy. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 151-163 (2006).
- Wyckoff, J. B., Wang, Y., Lin, E. Y., Li, J. F., Goswami, S., Stanley, E. R., Segall, J. E., Pollard, J. W., Condeelis, J. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).
- Egeblad, M., Ewald, A. J., Askautrud, H. A., Truitt, M. L., Welm, B. E., Bainbridge, E., Peeters, G., Krummel, M. F., Werb, Z. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Adrian, U. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2604-2609 (2003).
- Kedrin, D., Gligorijevic, B., Wyckoff, J., Verkhusha, V. V., Condeelis, J., Segall, J. E., van Rheenen, J. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5, 1019-1021 (2008).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nat. Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
