Immunocoloration lots pour la détection de protéines à grande échelle dans le cerveau du singe entier
Summary
À grande échelle immunodétection des protéines cibles à travers le cerveau entier primates est possible en employant des tissus roman enrobage et de sectionnement des méthodes combinées avec l'utilisation d'appareils pour la coloration créative lot de plusieurs sections flottant à un moment donné.
Abstract
L'immunohistochimie (IHC) est l'une des techniques de laboratoire les plus utilisés pour la détection des protéines cibles<em> In situ</em>. Les questions concernant le profil d'expression d'une protéine cible dans le cerveau entier est relativement facile de répondre lorsque vous utilisez l'IHC dans les cerveaux de petites, comme celles des rongeurs. Toutefois, répondre aux mêmes questions dans un grand cerveau et alambiquée, comme ceux des primates présente un certain nombre de défis. Nous présentons ici une approche systématique pour l'immunodétection des protéines cibles dans un cerveau de singe adulte. Cette approche s'appuie sur le tissu enrobage et de sectionnement méthodologie de NeuroScience Associés (NSA) ainsi que des outils développés spécifiquement pour les lots de la coloration flottant sections. Il en résulte une coloration uniforme d'un ensemble de sections qui, à un intervalle particulier, représente l'ensemble du cerveau. Les sections résultant tachés peuvent être soumis à une grande variété de procédures d'analyse afin de mesurer les niveaux de protéines, la population de neurones exprimant une certaine protéine.
Protocol
Discussion
Il ya deux étapes essentielles de cette procédure qui font à grande échelle de détection des protéines dans un cerveau de singe toute possible. L'un est le protocole enrobage et de sectionnement, qui reste le savoir-faire exclusif de la NSA. L'autre est l'utilisation de bacs de coloration et paniers fournis par HistoTools. Ce dernier permet une manipulation facile et rapide d'un grand nombre (~ 40) sections à un moment donné. Il fournit également les moyens de traiter uniformément toutes les se…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à Frank Ervin, Roberta Palmour et le personnel des laboratoires de sciences du comportement de la Fondation situé à St-Kitts, dans les Antilles, pour leur soutien continu de notre travail primates. Ce travail a été soutenu par une bourse de la Fondation X Fragile de recherches du Canada (FCRSXF) pour la SZ et – les subventions de fonctionnement des Instituts canadiens de recherche en santé (AC) et le National de l'Ingénierie et de Conseil de recherches du Canada (MP).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| anti-FMRP monoclonal antibody | Chemicon | MAB2160 | Requires antigen retrieval in fixed tissue. | |
| anti-NeuN monoclonal antibody | Chemicon | MAB377 | N/A | |
| anti-Neurofilament H monoclonal antibody | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI32 | N/A | |
| Antigen Unmasking Solution | Vector Laboratories | H-3300 | N/A | |
| Normal horse serum | Invitrogen | 16050122 | 500 mL | |
| Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in horse | Vector Laboratories | BA-2000 | ||
| VECTASTAIN ABC Kit (Standard) | Vector Laboratories | PK-4000 | 1.5 mg | |
| Staining dish for floating sections | HistoTools | 10009 | 12 x 65 mm | |
| Staining transport basket | HistoTools | 10012 | large (fits 12 x 65 mm dish) |
|
| Triton X-100 | Fisher Scientific | P8514B | N/A | |
| DAB | Fisher Scientific | AC11209-0050 | N/A |
References
- Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. . Guide to the Care and Use of Experimental Animals. , (1993).
- Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat Genet. 4, 335-340 (1993).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116, 201-211 (1992).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).
