Virale silenziamento genico (VIGS) in Nicotiana benthamiana E Pomodoro
Summary
Descrizione di un virus-indotto silenziamento genico (VIGS) metodo per knock-down di espressione genica in<em> Nicotiana benthamiana</em> E pomodoro.
Abstract
Interferenza dell'RNA (RNAi) è altamente specifico silenziamento genico fenomeno innescato da dsRNA 1. Questo meccanismo di silenziamento utilizza due grandi classi di RNA regolatori: microRNA, che sono prodotte da geni che codificano proteine e non breve RNA interferenti (siRNA). Le piante usano RNAi per controllare trasposoni e di esercitare uno stretto controllo sui processi di sviluppo come la formazione di organi di fiori e foglie sviluppo 2,3,4. Piante anche usare RNAi per difendersi contro le infezioni da virus. Di conseguenza, molti virus si sono evoluti soppressori di silenziamento genico per consentire loro colonizzazione successo del loro ospite 5.
Virale silenziamento genico (VIGS) è un metodo che sfrutta la RNAi mediato da meccanismi di difesa piante antivirali. In piante infette da virus modificato il meccanismo è specificamente mirate contro il genoma virale. Tuttavia, con vettori di virus che trasportano sequenze derivate da geni dell'organismo ospite, il processo può essere ulteriormente mirate contro il mRNA host corrispondente. VIGS è stato adattato per la genomica funzionale high-throughput nelle piante utilizzando il patogeno per le piante Agrobacterium tumefaciens per fornire, tramite il suo Ti plasmide, un virus ricombinante portando l'intero o parte della sequenza genica mirata per tacere. Diffusione del virus sistemico e il endogeno impianti RNAi macchinari prendersi cura del resto. dsRNAs corrispondente al gene bersaglio vengono prodotti e poi scisso dal Dicer ribonucleasi in siRNA del 21-24 nucleotidi di lunghezza. Queste siRNA in ultima analisi, guida l'RNA di silenziamento indotto complesso (RISC) a degradare la trascrizione obiettivo 2.
Diversi vettori sono stati impiegati in VIGS e uno dei più frequentemente utilizzato è basato su tabacco sonaglio virus (TRV). TRV è un virus bipartito e, come tale, A. due diversi ceppi di Agrobacterium sono usati per VIGS. Si porta pTRV1, che codifica le funzioni di replicazione virale e il movimento, mentre l'altro, pTRV2, porti la proteina di rivestimento e la sequenza usata per VIGS 6,7. Inoculazione di Nicotiana benthamiana e di piantine di pomodoro con un misto di entrambi i risultati ceppi di silenziamento genico. Silenziamento del endogeno phytoene desaturasi (PDS) del gene, che provoca photobleaching, viene utilizzato come controllo per l'efficienza VIGS. Va notato, tuttavia, che il silenziamento di pomodoro è generalmente meno efficiente rispetto a N. benthamiana. Abbondanza trascrizione dell'RNA del gene di interesse deve essere sempre misurata per garantire che il gene bersaglio è stato efficacemente down-regolato. Tuttavia, sequenze di geni eterologhi da N. benthamiana può essere utilizzato per mettere a tacere i rispettivi ortologhi di pomodoro e viceversa 8.
Protocol
Discussion
Virale silenziamento genico è un metodo che permette un rapido schermi della genetica inversa. Evita la generazione di T-DNA o geni mediata trasposone knock-out, che sono disponibili solo in alcune piante come Arabidopsis e mais. Si aggira anche il processo che richiede tempo di trasformazione di piante e permette il targeting dei geni multipli allo stesso tempo, a condizione che abbiano homology sufficienti 10 o che diverse sequenze di host di destinazione sono disposti in tandem nel silenzio Vetto…
Acknowledgements
Ringraziamo il Dott. Patricia Manosalva per le sue preziose informazioni sul manoscritto. Il finanziamento è stato fornito dal Programma Nazionale Genoma Plant Science Foundation, il numero di riconoscimento DBI-0605059.
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