Detecção de Ubiquitinação Protein

Summary

Ubiquitinação é uma modificação fundamental posttranslational realizado por um conjunto de três enzimas. Mutações dos genes envolvidos nesta modificação estão associadas com diferentes tipos de doenças humanas. Aqui, descrevemos os protocolos para detectar ubiquitinação de proteínas em células cultivadas<em> In vivo</emTubos> e testar<em> In vitro</em>.

Abstract

Ubiquitinação, a ligação covalente da ubiquitina polipeptídeo como alvo as proteínas, é uma modificação fundamental posttranslational realizado por um conjunto de três enzimas. Eles incluem a ativação da enzima ubiquitina-E1, E2 conjugando ubiquitina-enzima, e E3 ubiquitina ligase. Ao contrário de E1 e E2, E3 ubiquitina ligases especificidade substrato mostrar. Por outro lado, numerosas enzimas deubiquitylating têm funções no processamento de proteínas poliubiquinadas. Ubiquitinação pode resultar em mudança de estabilidade da proteína, localização celular e atividade biológica. Mutações de genes envolvidas na via ubiquitinação / deubiquitination ou função alterada do sistema ubiquitina estão associadas com diversas doenças humanas, como vários tipos de cancer, neurodegeneração, e distúrbios metabólicos. A detecção de ubiquitinação alterado ou normal de proteínas-alvo pode fornecer uma melhor compreensão sobre a patogênese dessas doenças. Aqui, descrevemos os protocolos para detectar ubiquitinação de proteínas em células cultivadas<em> In vivo</emTubos> e testar<em> In vitro</em>. Estes protocolos também são úteis para detectar outras ubiquitina-like modificação pequena molécula, como sumolyation e neddylation.

Protocol

Detecção de ubiquitinação de proteínas em células cultivadas Transfecção as células cultivadas com plasmídeos expressando a proteína de interesse e (epítopo-tagged versão) ubiquitina. Faça lise completa das células (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) com 2mM ortovanadato de sódio, 50 mM de fluoreto de sódio, e os inibidores da protease. Lisar células com 100 mL de buffer de células por placa de lise (6 prato cm). Se uma antena maior é usado, ajustar o volume e…

Discussion

Nesta apresentação, descrita pela primeira vez os passos que permitem a detecção de modificação ubiquitina em uma proteína de interesse em culturas de células de mamíferos. A fim de detectar ubiquitinação especificamente sobre a proteína de interesse, e não sobre proteínas não-covalentemente interagindo, usamos uma condição rigorosos para a lise celular, imunoprecipitação e lavagem ^1,3. Ubiquitinação, detectadas por imunoprecipitação de proteínas-alvo em uma condição tão dura seguid…