В этом видео мы представляем<em> Исключая виво</em> Поколения и расширение человеческой CD40-активированных В-клеток (CD40-B) из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) путем стимуляции CD40 лиганд и интерлейкина-4.
CD40 активированных В-клеток (CD40-лимфоцитов) были определены в качестве альтернативного источника иммуно-стимулирующего антиген-представляющих клеток (АПК) для иммунотерапии рака 1-3. По сравнению с дендритные клетки (ДК), лучше всего характеризует APC, CD40-лимфоцитов иметь несколько различных биологических и технических свойств. Как и в DC, В-клетки показывают повышенную экспрессию МНС и костимулирующих молекул (рис.1б), проявляют сильный миграционный потенциал и настоящее презентации антигена эффективно Т-клетки, после стимуляции интерлейкина-4 и CD40 лиганда (CD40L). Однако, в отличие от незрелых или зрелых ДК, CD40-B клетки экспрессируют полный лимфатических узлов самонаведения триаду, состоящую из CD62L, CCR7/CXCR4 и лейкоцитов функции антиген-1 (LFA1, CD11a/CD18), необходимых для наведения на вторичных лимфоидных органах (рис. 1а) 3. CD40-B клетки могут быть получены без трудностей от очень небольших количествах периферической крови, которая может быть расширена в пробирке до очень большого количества высоко-чистые CD40-лимфоцитов (> 10 9 клеток на одного пациента) от здоровых доноров, а также рака пациентов (Fig.1c, г) 1,4.
В этом протоколе мы покажем, как получить полностью активирована CD40-В-клетки из человеческой РВМС. Основные молекулы, для культуры клеток являются CD40 лиганд, интерлейкин-4 (ИЛ-4) и циклоспорин (CSA), которые пополняются в 3-4 цикла культура день. Для лабораторных целей CD40 стимуляции обеспечивается NIH/3T3 клеток, экспрессирующих рекомбинантный человеческий CD40 лиганд (tCD40L NIH/3T3) 5. Во избежание загрязнения с неправительственными организациями, трансфицированных клеток, экспрессию человеческого CD40 лиганда на трансфектантов должен регулярно проверяться (рис.2).
После 14 дней CD40-B культурах клеток состоят из более чем 95% чистой клеток и расширение CD40-B клеток в течение 65 дней часто удается без потери функции 1, 4. CD40-В-клеток эффективно заниматься, обработки и представления антигенов Т-клеток 6. Они не только простые naϊve, но и расширяют ячеек памяти T 7,8. CD40 активированных В-клеток может быть использована для изучения В-клеточной активации, дифференцировки и функции. Более того, они представляют собой перспективный инструмент для использования в терапевтических или профилактических прививок против опухолей 9.
A. Preparation of Media:
Feeder cell wild type medium | Feeder cell selection medium | ||
Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
DMEM-Ham’s / F12 | DMEM-Ham’s / F12 | ||
L-Glutamine | 365 μg/mL | L-Glutamine | 365 μg/mL |
FBS | 10 % | FBS | 10 % |
HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
G-418 | 0.7 mg/mL |
CD40-B washing medium | CD40-B culture medium | ||
Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
IMDM | |
IMDM | |
L-Glutamine | 584 μg/mL | L-Glutamine | 584 μg/mL |
HEPES | 25 mM | HEPES | 25 mM |
Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
rh Transferrin | 50 μg/mL | ||
rh Insulin | 5 μg/mL | ||
AB-Humanserum | 10 % |
B. Miscellaneous Reagents:
Reagent | Company | Order No |
DMEM / Ham’s F12 | PAA | Cat No: E15-813 |
IMDM | Invitrogen Gibco® | REF 21980-032 |
Dulbecco’s PBS (10x) | PAA | Cat No H15-011 |
AB-Human Serum | Invitrogen | Cat No 34005100 |
holo-Transferrin human | Sigma | Cat No T0665 |
Insulin human | Sigma | Cat No I2643 |
Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 |
Recombinant Human Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 11130045 |
Cyclosporin A | Novartis | Cat No NDC 0078-0109-01 |
FBS | LONZA | Cat No DE14-802C |
HEPES Buffer | PAA | Cat No S11-001 |
G-418 Sulphate | PAA | Cat No P02-012 |
Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen Gibco® | REF 15400-054 |
C. Miscellaneous Supplies:
Reagent | Company | Order No |
Sterile pipette tips | Sarstedt | |
6-well plate | NUNC | Cat No 140675 |
50mL conical tube | BD Falcon™ | Cat No 352070 |
Tissue culture flask | SARSTEDT | Cat No 83.1813.002 |