이 비디오에서는 소개 예 생체내 생성 및 확장 (CD40 - B).
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이 논문에서
요약
초록
CD40 - 활성화된 B 세포는 (CD40 - B 세포) 단백질 stimulatory 항원 제시 암 immunotherapy에 대한 세포 (APC하는) 1-3의 대체 소스로 확인되었습니다. CD40 - B 세포가 여러 가지 서로 다른 생물 학적 및 기술적 특성을 가지고 돌기 세포 (DCS), 최고의 특징 APC, 비교. DC가 마찬가지로, B 세포는 MHC와 공동 stimulatory 분자 (Fig.1b)의 증가 표현을 표시, 인터루킨 - 4 및 CD40 리간드 (CD40L)와 자극 후 강력한 철새 용량과 효율적인 T 세포에 존재 항원 프레 젠 테이션을 나타냅니다. 그러나, 미숙 또는 성숙 DC가와는 대조적으로, CD40 - B 세포는 CD62L, CCR7/CXCR4 이루어진 전체 림프절 유도 깡패을 표현하고, 보조 림프 기관으로 유도하기 위해 필요한 백혈구 기능 항원 - 1 (LFA1, CD11a/CD18) (Fig.1a) 3. CD40 - B 세포는 더욱 높은 순수 CD40 - B 세포를 건강한 기증자로부터 (> 10 9 환자 당 세포)뿐만 아니라 암 매우 다량으로 체외로 확장시킬 수 말초혈 매우 소량의 어려움없이 생성할 수 있습니다 환자 (Fig.1c, D) 1,4.
이 프로토콜에서 우리는 인간의 PBMC에서 완벽하게 작동 CD40 - B 세포를 얻는 방법을 보여줍니다. 세포 배양을위한 주요 분자는 CD40 리간드, 인터루킨 -4 (IL - 4) 및 시클 로스 포린 A (CSA), 3~4일 문화주기에 보충함하는. 아르 실험 목적 CD40 - 자극은 재조합 인간 CD40 리간드 (tCD40L NIH/3T3) 5을 표현 NIH/3T3 세포에 의해 제공됩니다. 비 transfected 세포와 오염을 방지하려면 transfectants에있는 인간 CD40 리간드 표현 (Fig.2) 정기적으로 확인되어야한다.
십사일 후 CD40 - B 세포 배양 이상 순도 95 프로지 B 세포 65 일 동안 CD40 - B 세포의 확장 기능을 1, 4의 손실없이 자주이 가능합니다 구성되어 있습니다. CD40 - B 세포가 효율적으로 프로세스를 차지하고 T 세포에 항원 제시 6. 그들은 소수 naϊve 모르지만, 또한 메모리 T 세포에게 7,8를 확장합니다. CD40 - 활성화된 B 세포는 B - 세포 활성화, 차별과 기능을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 그들은 종양에 대한 치료 또는 구 예방 접종을위한 유망한 도구를 나타냅니다.
프로토콜
PBMC에서 인간 CD40 - 활성 B 세포의 생성에 대한 프로토콜은 두 부분으로 나뉘어져 있습니다 : 제 플레이트 - 바운드 피더 세포로 사용됩니다 NIH/3T3 세포를 표현 CD40 리간드의 준비를 보여줍니다. 파트 B는 실제 CD40 - B 문화를 설명합니다.
피더 세포의 A. 준비 (tCD40L NIH/3T3)
tCD40L NIH/3T3 완전히 합류가해서는 안 자기편 murine fibroblast 세포 라인입니다. 세포 따라서 주당 두번 splitted 수 있습니다. 6 개 이상 주 동안 Culturing하지 않는 것이 좋습니다.
- 멸균 피펫으로 기본 문화 올드 미디어를 제거하고 1X PBS의 10 ML과 세포를 씻으십시오. 세척 후 PBS를 대기음.
- 37 5-10분에 75cm 2 플라스크 4 ML 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가 ° C. 세포를 분리하기 위해 부드러운 도청을 사용합니다.
- 야생 유형 매체 10 ML을 추가하고 부드럽게 회전.
- 멸균 피펫과 50 ML 튜브에 세포 현탁액을 전송 5 분 225 XG에서 세포를 스핀 다운.
- 뜨는을 제거....
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재료
미디어 A. 준비 :
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 피더 세포 야생 유형 매체 | 피더 셀 선택 매체 | ||
| 시약 | 집중 | 시약 | 집중 |
| DMEM - 햄의 / F12 | DMEM - 햄의 / F12 | ||
| L - 글루타민 | 365 μg / ML | L - 글루타민 | 365 μg / ML |
| FBS | 10% | FBS | 10% |
| HEPES | 10 MM | HEPES | 10 MM |
| Gentamycin | 15 μg / ML | Gentamycin | 15 μg / ML |
| G - 418 | 0.7 MG / ML | ||
| CD40 - B 세척 매체 | CD40 - B 문화 매체 | ||
|---|---|---|---|
| 시약 | 집중 | 시약 | 집중 |
| IMDM | IMDM | ||
| L - 글루타민 | 584 μg / ML | L - 글루타민 | 584 μg / ML |
| HEPES | 25 MM | HEPES | 25 MM |
| Gentamycin | 15 μg / ML | Gentamycin | 15 μg / ML |
| RH 트랜스페린 | 50 μg / ML | ||
| RH 인슐린 | 5 μg / ML | ||
| AB - Humanserum | 10% | ||
B. 기타 시약 :
| 시약 | 회사 | 아니오를 주문하지 |
|---|---|---|
| DMEM / 햄의 F12 | PAA | 고양이 번호 : E15 - 813 |
| IMDM | Invitrogen Gibco ® | REF 21980-032 |
| Dulbecco의 PBS (10X) | PAA | 고양이도없는 H15 - 011 |
| AB - 인간 혈청 | Invitrogen | 고양이도없는 34,005,100 |
| 홀로그램 트랜스페린 인간 | 시그마 | 고양이도없는 T0665 |
| 인슐린 인간 | 시그마 | 고양이도없는 I2643 |
| Gencin ® | 델타 선택 | 예술 없음 7,395,800 |
| 재조합 인간 인터루킨 - 4 | Immunotools | 고양이도없는 11,130,045 |
| 시클 로스 포린 | 노바티스 | 고양이도없는 NDC 0078-0109-01 |
| FBS | LONZA | 고양이도없는 DE14 - 802C |
| HEPES 버퍼 | PAA | 고양이도없는 S11 - 001 |
| G - 418 황산염 | PAA | 고양이도없는 P02 - 012 |
| 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (10X) | Invitrogen Gibco ® | REF 15400-054 |
C. 기타 용품 :
| 시약 | 회사 | 아니오를 주문하지 |
|---|---|---|
| 멸균 피펫 팁 | Sarstedt | |
| 6 - 웰 플레이트 | NUNC | 고양이도 140,675 |
| 50mL 원뿔 관 | BD 팰컨 ™ | 고양이도 352,070 |
| 조직 문화 플라스크 | SARSTEDT | 고양이도없는 83.1813.002 |
참고문헌
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).
- Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S.
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