Génération de l'homme CD40-B activés cellules

Summary

Dans cette vidéo, nous présentons les<em> Ex vivo</emGénération> et l'expansion des cellules B CD40-activées (CD40-B) à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) par stimulation par CD40 ligand et l'interleukine-4.

Abstract

CD40-activé des cellules B (CD40-cellules B) ont été identifiés comme une source alternative de l'immuno-stimulation des cellules présentatrices d'antigènes (APC) pour l'immunothérapie du cancer ^1-3. Comparé aux cellules dendritiques (CD), la meilleure APC caractérisée, les cellules CD40-B ont plusieurs propriétés biologiques distinctes et techniques. Similaires aux PED, les cellules B montrent une augmentation de l'expression du CMH et des molécules de co-stimulation (Fig. 1b), présentent une forte capacité migratoire et la présentation des antigènes présents efficacement aux cellules T, après stimulation par un ligand interleukine-4 et CD40 (CD40L). Cependant, contrairement aux CD immatures ou matures, les cellules CD40-B expriment la triade lymphatiques pleine noeud homing composé de CD62L, CCR7/CXCR4, et la fonction des leucocytes antigènes-1 (LFA1, CD11a/CD18), nécessaires à tête chercheuse d'organes lymphoïdes secondaires (Fig.1a) ^3. Cellules CD40-B peuvent être générés sans difficultés à partir de très petites quantités de sang périphérique qui peut être élargi in vitro à de très grandes quantités de très-pur-CD40 des cellules B (> 10 ⁹ cellules par patient) provenant de donneurs sains ainsi que le cancer patients (Fig.1c, d) ^1,4.

Dans ce protocole, nous montrons comment obtenir pleinement activé CD40-B à partir des cellules PBMC humaines. Molécules clés pour la culture cellulaire sont CD40-ligand, l'interleukine-4 (IL-4) et la cyclosporine A. (CSA), qui sont reconstituées dans un cycle de culture de 3-4 jours Aux fins de laboratoire CD40-stimulation est fournie par des cellules exprimant NIH/3T3 humaine recombinante ligand CD40 (tCD40L NIH/3T3) ^5. Pour éviter la contamination par des cellules non transfectées, l'expression du ligand CD40 humaine sur les transfectants doit être vérifié régulièrement (Fig.2).

Après 14 jours de CD40-B cultures cellulaires consistent de plus de 95% de cellules B pur et une expansion des cellules CD40-B de plus de 65 jours est souvent possible sans aucune perte de fonction ^{1, 4.} Cellules CD40-B efficacement relever, traiter et présenter les antigènes aux cellules T ^6. Ils ne sont pas seulement naϊve écoute, mais également d'élargir les cellules T mémoire ^7,8. CD40-activé des cellules B peut être utilisé pour étudier activation des cellules B, la différenciation et la fonction. Par ailleurs, ils représentent un outil prometteur pour la vaccination thérapeutique ou préventive contre les tumeurs ^9.

Protocol

Le protocole pour la génération des cellules B CD40 humains activés à partir des PBMC est divisé en deux parties: la partie A montre la préparation du ligand CD40 exprimant cellules NIH/3T3, qui sera utilisée comme plaque de cellules nourricières lié. Partie B décrit les réelles CD40-B de la culture. A. Préparation de cellules nourricières (tCD40L NIH/3T3) Le NIH/3T3 tCD40L est une adhérente lignée murine de cellules fibroblastes, qui ne devrait jama…

Materials

A. Preparation of Media:

Feeder cell wild type medium		Feeder cell selection medium
Reagent	Concentration	Reagent	Concentration
DMEM-Ham’s / F12		DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine	365 μg/mL	L-Glutamine	365 μg/mL
FBS	10 %	FBS	10 %
HEPES	10 mM	HEPES	10 mM
Gentamycin	15 μg/mL	Gentamycin	15 μg/mL
		G-418	0.7 mg/mL

CD40-B washing medium		CD40-B culture medium
Reagent	Concentration	Reagent	Concentration
IMDM		IMDM
L-Glutamine	584 μg/mL	L-Glutamine	584 μg/mL
HEPES	25 mM	HEPES	25 mM
Gentamycin	15 μg/mL	Gentamycin	15 μg/mL
		rh Transferrin	50 μg/mL
		rh Insulin	5 μg/mL
		AB-Humanserum	10 %

B. Miscellaneous Reagents:

Reagent	Company	Order No
DMEM / Ham’s F12	PAA	Cat No: E15-813
IMDM	Invitrogen Gibco®	REF 21980-032
Dulbecco’s PBS (10x)	PAA	Cat No H15-011
AB-Human Serum	Invitrogen	Cat No 34005100
holo-Transferrin human	Sigma	Cat No T0665
Insulin human	Sigma	Cat No I2643
Gencin®	Delta Select	Art No 7395800
Recombinant Human Interleukin-4	Immunotools	Cat No 11130045
Cyclosporin A	Novartis	Cat No NDC 0078-0109-01
FBS	LONZA	Cat No DE14-802C
HEPES Buffer	PAA	Cat No S11-001
G-418 Sulphate	PAA	Cat No P02-012
Trypsin/EDTA (10x)	Invitrogen Gibco®	REF 15400-054

C. Miscellaneous Supplies:

Reagent	Company	Order No
Sterile pipette tips	Sarstedt
6-well plate	NUNC	Cat No 140675
50mL conical tube	BD Falcon™	Cat No 352070
Tissue culture flask	SARSTEDT	Cat No 83.1813.002