Mikroinjektion Tekniker för att studera Mitos i Drosophila melanogaster Syncytial Embryo
Summary
Detta protokoll beskriver användning av mikroinjektion och högupplösande avbildning i<em> Drosophila melanogaster</em> Syncytial embryot att studera mitos.
Abstract
Detta protokoll beskriver användningen av Drosophila melanogaster syncytial embryo för att studera mitos 1. Drosophila har bra genetik med ett ordnat genomet, och det kan vara lätt att underhålla och manipuleras. Många mitotiska mutanter existerar och transgena flugor uttrycka funktionella fluorescerande (t.ex. GFP) – taggade mitotiska proteiner har och håller på att skapas. Riktade genuttryck är möjlig med GAL4/UAS system 2.
Den Drosophila tidiga embryot utför flera mitoses mycket snabbt (cellcykeln varaktighet, ≈ 10 min). Det är väl lämpad för bildhantering mitos, eftersom det under cykler 10-13, kärnor delar snabbt och synkront utan att ingripa cytokines på ytan av embryot i en enda monolager precis under cortex. Dessa snabbt delande kärnor använder antagligen samma mitotiska maskiner som andra celler, men de är optimerade för hastighet, riktpunkten är allmänt tros inte vara stränga, vilket gör att studien av mitotiska proteiner vars frånvaro skulle orsaka gripandet cellcykeln i celler med en stark checkpoint . Embryon som uttrycker GFP märkta proteiner eller idag injiceras med fluorescerande proteiner kan lätt avbildas följa leva dynamik (Fig. 1). Dessutom kan embryon idag injiceras med funktion-blockerande antikroppar eller hämmare av specifika proteiner för att studera effekten av förlust eller störning av deras funktion 3. Dessa reagenser kan sprida i hela embryot, nå många spindlar för att producera en lutning på koncentration av hämmare, som i sin tur resulterar i en gradient av defekter kan jämföras med en allela serie av mutanter. Helst om målprotein fluorescerande är märkt, kan lutning på inhibition direkt visualiseras 4. Det förutsätts att den starkaste fenotypen är jämförbart med noll fenotypen, men det är svårt att formellt utesluta att antikroppar kan ha dominerande effekter i sällsynta fall, så en noggrann kontroll och försiktig tolkning måste tillämpas. Längre bort från injektionsstället är proteiners funktion endast delvis förlorat låta andra funktioner målprotein för att bli uppenbara.
Protocol
Discussion
Detta protokoll är relativt enkelt, men kräver att varje steg i praktiken att se till att embryona inte är skadade. Noggrann kontroll experiment måste alltid göras för att säkerställa att tillförlitliga resultat kan uppnås. Ett bra sätt att börja detta är microinjecting buffert eller Rhodamine tubulin till kontroll embryon som uttrycker GFP-tubulin att se till att celldelningen i normalfallet går igenom alla cyklar på embryot ytan (cykler 10 till 13). Kontroll embryon bör du inte observera några fysiska…
Acknowledgements
Detta protokoll används idag i vårt laboratorium och har förfinats under årens lopp av många människor, inklusive Dr David Sharp, Mijung Kwon, Patrizia Sommi, Dhanya Cheerambathur. Vi tackar Dr Bill Sullivan (UCSC) som gav oss goda råd om manipulation och mikroinjektion av tidig Drosophila embryon när vårt arbete i detta system hade inletts (ref. 13). Vi tackar alla medlemmar i Scholey laboratoriet. Vårt arbete med mitos på Drosophila stöds av NIH bidrag GM55507.
References
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Mitotic spindle dynamics in Drosophila. Int Rev Cytol. 259, 139-172 (2007).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
- Morris, R. L. Microinjection methods for analyzing the functions of kinesins in early embryos. Methods Mol Biol. 164, 163-172 (2001).
- Brust-Mascher, I., Sommi, P., Cheerambathur, D. K., Scholey, J. M. Kinesin-5-dependent poleward flux and spindle length control in Drosophila embryo mitosis. Mol Biol Cell. 20, 1749-1762 (2009).
- Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Kwon, M., Mogilner, A., Scholey, J. M. Model for anaphase B: role of three mitotic motors in a switch from poleward flux to spindle elongation. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15938-15943 (2004).
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microtubule flux and sliding in mitotic spindles of Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 13, 3967-3975 (2002).
- Cheerambathur, D. K., Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. Dynamic partitioning of mitotic kinesin-5 crosslinkers between microtubule-bound and freely diffusing states. J Cell Biol. 182, 421-428 (2008).
- Cheerambathur, D. K. Quantitative analysis of an anaphase B switch: predicted role for a microtubule catastrophe gradient. J Cell Biol. 177, 995-1004 (2007).
- Kwon, M. The chromokinesin, KLP3A, dives mitotic spindle pole separation during prometaphase and anaphase and facilitates chromatid motility. Mol Biol Cell. 15, 219-233 (2004).
- Sharp, D. J. Functional coordination of three mitotic motors in Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 11, 241-253 (2000).
- Sharp, D. J. The bipolar kinesin, KLP61F, cross-links microtubules within interpolar microtubule bundles of Drosophila embryonic mitotic spindles. J Cell Biol. 144, 125-138 (1999).
- Sharp, D. J., Rogers, G. C., Scholey, J. M. Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos. Nat Cell Biol. 2, 922-930 (2000).
- Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos. Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).
- Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells. Curr Biol. 8, 1227-1230 (1998).
