Grandes Inserir Produção Ambiental Biblioteca Genômica
Summary
Construção de uma biblioteca fosmid com DNA genômico ambiental isolado do contínuo de profundidade vertical de um fiorde sazonalmente hipóxica é descrito. A biblioteca clone resultante é escolhido em 384 poços pratos e arquivados para seqüenciamento e análise funcional a jusante pela aplicação de um sistema automatizado colônia colheita.
Abstract
A grande maioria dos micróbios na natureza atualmente permanecem inacessíveis aos métodos tradicionais de cultivo. Durante a última década, a cultura independente de genômica ambiental (<em> Ou seja,</em> Metagenomic) abordagens surgiram, permitindo aos investigadores para colmatar esta lacuna através da captura de cultivo o conteúdo genético de comunidades microbianas indígenas diretamente do ambiente. Para este fim, bibliotecas de DNA genômico são construídos usando o padrão ainda técnicas de clonagem artful laboratório. Aqui, descrevemos a construção de uma grande biblioteca genômica ambiental inserir fosmid com DNA derivado da continuidade de profundidade vertical de um fiorde sazonalmente hipóxica. Este protocolo está diretamente ligada a uma série de protocolos ligados incluindo amostragem costeiros marinhos de água [1], filtração grande volume de biomassa microbiana [2] e uma extração de DNA e protocolo de purificação [3]. No início, o DNA genômico de alta qualidade é reparada final, com a criação de 5-fosforilada termina sem corte. Fim-reparado DNA é submetido a eletroforese em campo pulsado gel (PFGE) para seleção de tamanho e extração de gel é executada para recuperar fragmentos de DNA entre 30 e 60 mil pares de base (Kb) de comprimento. DNA tamanho selecionado é purificado longe da matriz de gel PFGE e ligada à fosfatase tratados com blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (Epicentro<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"> Http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Concatemers linear de pCC1 e DNA de inserção são posteriormente headfull empacotados em partículas de fago lambda por terminase, com infecção subseqüente de resistentes aos fagos<em> E. coli</em> Células. Clones com sucesso transduzidas são recuperados em placas de agar LB sob seleção de antibióticos e arquivadas em formato de 384 poços da placa usando uma colônia automatizado escolher robô (Qpix2, Genetix). O protocolo atual baseia-se em várias fontes, incluindo o CopyControl Kit de Produção da Biblioteca Fosmid Epicentro e os trabalhos publicados de vários grupos de pesquisa [4-7]. Cada passo é mostrado com as melhores práticas em mente. Sempre que possível, destacar sutilezas na execução para melhorar a qualidade ea eficiência global da produção biblioteca. Todo o processo de produção biblioteca fosmid e escolhendo colônia automatizado leva pelo menos 7-10 dias, pois há muitos passos de incubação incluídos. No entanto, existem vários pontos de parada possível, que são mencionados no âmbito do protocolo.
Protocol
Discussion
Um procedimento é descrito como mais eficiente gerar uma grande biblioteca a inserir fosmid com DNA genômico derivado de uma amostra de água costeiras. A montante extração do DNA genômico é descrito em um protocolo separado [3].
Como a produção fosmid-biblioteca é um processo de várias etapas, plano de pelo menos duas a três semanas a tempo para todo o procedimento, incluindo todos os passos quatro apresentaram. A extração de DNA genômico é o passo mais crucial e todos os flu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer à Fundação Canadense para Inovação, a British Columbia Fundo de Desenvolvimento do Conhecimento e das Ciências e Pesquisa de Engenharia National Council (NSERC) do Canadá para apoiar estudos em andamento em regiões de baixo oxigênio das águas oceânicas costeiras e aberto. MT e SL foram apoiados por bolsas de estudo do Centro de fundação TULA financiado pela Diversidade Microbiana e Evolution (CMDE). MT também recebeu apoio bolsa da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Step II | ||||
| CopyControl™ Fosmid Library Production Kit | EPICENTRE | CCFOS110 | sufficient to generate 9-10 fosmid libraries | |
| SeaPlaque Agarose | Cambrex | 50100 | ||
| stirring hot plate | Corning | PC-420D | ||
| 1.0X TAE running buffer | ||||
| CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump | Bio-Rad | |||
| λ DNA-HindIII Digest | NEB | N3012S | ||
| MidRange I PFG Marker | NEB | N3551S | ||
| 10,000X SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | ||
| microwavable plastic wrap | Saran premium wrap | |||
| Safe Imager transilluminator | Invitrogen | S37102 | ||
| GELase Agarose Gel-Digesting Preparation | EPICENTRE | G09100 | ||
| scalpel | Fisher Scientific | 08-927-5D | ||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC801024 | ||
| Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit | Millipore | 42410 | ||
| nuclease free water | Ambion | AM9932 | ||
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# | Invitrogen | P7589 | ||
| digital dry block heater | VWR | 12621-088 | ||
| water bath | VWR | 14231-854 | ||
| centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E | ||
| centrifuge rotor | Beckman Coulter | JA 5.3 | ||
| table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | ||
| microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear | Axygen | MCT-175-C | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| Step III | ||||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643 | ||
| phage dilution buffer | 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 | |||
| cryogenic vials | Fisher-Corning | 430488 | ||
| Step IV | ||||
| 96 well plate with lid | Fisher-Corning | CS003370(3370) | ||
| 384 well plate with lid | Fisher-Corning | 07201157(3680) | ||
| Petri dishes 100 O.D. x 15mm H | Fisher | 08-757-12 | ||
| Petri dishes 150 Dia. x 15mmH | Fisher | 08-757-14 | ||
| BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm | VWR | CABD351040 | ||
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | ||
| chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | ||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| Difco Agar | BD | 214530 | ||
| glass beads | Fisher Scientific | 10-310-1 | ||
| QFill3 | Genetix | X3050 | ||
| Bleach | Javex | |||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| QPix colony picker | Genetix | QPix2 | ||
| picking head (E. coli) | Genetix | X4006 |
References
- Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
- Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
- Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
- DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -. U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean’s interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).
