A criação de embriões quiméricos Zebrafish por Transplante
Summary
Um guia passo-a-passo para a geração de embriões alvo zebrafish quimérico de transplante em fase de blástula ou gástrula.
Abstract
Uma das mais poderosas ferramentas utilizadas para obter insights sobre os complexos processos de desenvolvimento é a análise de embriões quiméricos. Uma quimera é definida como um organismo que contém células de mais de um animal; mosaicos são um tipo de quimera em que as células de mais de um genótipo são misturados, geralmente do tipo selvagem e mutante. No peixe-zebra, quimeras podem ser facilmente feitas por transplante de células de um embrião de doador em um embrião hospedeiro no estágio apropriado embrionárias. Células do doador rotulados são geradas pela injeção de um marcador de linhagem, tal como um corante fluorescente, no embrião estágio de uma célula. Células do doador rotulados são removidos a partir de embriões de doadores e introduzidas em embriões de anfitrião unlabeled usando um óleo controlado pipeta de vidro montada em cada um composto ou um microscópio de dissecação. Células do doador pode, em alguns casos, ser direcionados a uma região específica ou tecido do embrião hospedeiro desenvolvimento blástula ou gástrula palco por escolher um site de transplante no embrião host com base em mapas bem estabelecida destino.
Protocol
Discussion
A facilidade com que o transplante pode ser usado para produzir quimeras alvo é uma das grandes potências do zebrafish como modelo vertebrados. A modificação do presente protocolo não descrito acima permite a análise da função dos genes maternos para a genes com funções essenciais no desenvolvimento zigóticos. Uma vez que estes peixes mutantes não podem sobreviver até a idade adulta, é necessário transferir a linha germinativa mutante em um embrião hospedeiro contrário do tipo selvagem, a criação de &…
Acknowledgements
Graças aos membros do laboratório para a entrada Moens útil durante a escrita deste artigo. HK é pós-doutorado apoiado pelo NIH / NICHD conceder # 5R01HD037909-08. CBM é um investigador com o Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Injection rig | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | Foot pedal can be ordered separately | |
| Pronase | Sigma | P5147 | “protease type XIV” | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458 | 100x stock | |
| Methyl cellulose | Sigma | M-0387 | ||
| Fluorescent dextrans | Molecular Probes/ Invitrogen | various | Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162) | |
| Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm) | Sutter | BF120-94-10 | ||
| Transplant pipette option 1 | World Precision Instruments | TW100-4 | ||
| Transplant pipette option 2 | VWR | #53508-400 | ||
| micromanipulator | Narishige | UMJ-3FC (?) | ||
| Micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-1 | ||
| Transplant apparatus | Sutter Instrument Co. | MI-10010 | ||
| Fine micromanipulator | Narishige | MMO-203 | ||
| Depression slides | Fisher | 12560A | ||
| Agar molds for injection and transplants | AL-AN Mfg, Inc. |
Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose.
References
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