우리는 시험 관내 CNS 축삭 - glia의 상호 작용 연구를위한 새로운 다중 구획 신경 공동 문화 microsystem 플랫폼을 개발했습니다. 플랫폼은 병렬 여섯 독립적인 실험까지 실시 수 있으며, 새로 개발된 마이크로 / 매크로 하이브리드 제조 방법을 사용하여 가공했습니다.
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이 논문에서
요약
초록
우리는 더 높은 처리량을위한 병렬 여섯 독립적인 실험까지 수행 능력이 체외의 CNS에서 축삭 - glia 상호 작용 연구를위한 새로운 다중 구획 신경 공동 문화 microsystem 플랫폼을 제시한다. 우리는 좋은 repeatability와 대량 제조를 가능하게 한 부드러운 리소그래피 프로세스를 통해 동일한 장치 내에서 마이크로 및 매크로 모두 규모 구조를 가지고 microfluidic 장치를 만들 수있는 새로운 제조 방법을 개발했습니다.
다중 구획 microfluidic 공동 문화 플랫폼 oligodendrocytes (OLs)의 뉴런 여섯 축삭 / glia 구획 하나의 소마 구획으로 구성되어 있습니다. 소마 구획 및 축삭 / glia 구획은의 배열에 의해 연결되어 있습니다 축삭 -지도 microchannels 그 axons은 축삭 / glia의 구획으로 성장할 수 있도록하면서 물리적 장벽이 소마 구획에의 연결 소마 범위를 제한하는 등 기능을 수행합니다. 축삭 / glia 구획에 로드된 OLs은화된 축삭 - glia 상호 작용 연구를 활성화, axons과 함께하지만 소마의 연결 또는 dendrites에만 연계해서 실행할 수 있습니다. microchannels은 또한 6 독립적인 실험이 더 높은 처리량을위한 단일 장치에서 실시 수 있도록, 구획 사이에 유체 절연을 활성화.
폴리 (dimethylsiloxane) (PDMS)을 사용하여 소프트 리소그래피는 생물 의학 microdevices에서 일반적으로 사용되는 기법입니다. 이러한 장치에 대한 저수지는 일반적으로 수동 펀칭에 의해 정의됩니다. 간단 가난한 정렬 및 프로세스의 시간이 소요되는 자연은 저수지 많은 수의 반복 작성해야 할 때이 과정이 적합하지합니다. 있지만 새로 개발된 방법은 이러한 한계를 극복, 저수지의 수동 펀칭을 필요로하지 않았다. 첫 번째, 일곱 저수지 (깊이 : 3.5 mm)는 마이크로 밀링 머신을 사용하여 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트) (PMMA) 블록에되었다. 그런 다음, 유리 기판에 대한 조작 리지 microstructures의 배열은, 소마와 축삭 / glia 구획을 연결 microchannels을 정의하는 PMMA 블록에 대한 핫 - 양각되었다. 이 프로세스는 하나의 PMMA 마스터 내에서 일치하는 매크로 규모의 저수지 (3.5 ㎜)와 마이크로 규모의 채널 (2.5 μm의) 결과. 금형 마스터 역할을 PDMS 복제는 소프트 리소그래피와 최종 PDMS 장치가이 마스터에서 복제되었다를 사용하여 얻은 것입니다.
E16 - 18 쥐의 기본 뉴런은 소마의 구획을 읽어 두 주 동안 교양되었습니다. 세포 배양 후 일주일 후, axons가 microchannels를 건너와 축삭 / glia 구획 안에 axonal는 네트워크 계층을 형성했다. Axons은 P1 - 2 쥐 6 축삭 / glia 구획 및 OLs에 걸쳐 균일하게 성장은 공동 문화 체외에 14 일 동안 축삭 / glia 구획에 추가되었습니다.
프로토콜
1 부 : 다중 구획을위한 마스터 몰드를 준비 신경 세포 공동 배양 장치 제작
- PMMA 마스터를 조작하는 첫 번째 단계는 3.5 mm 깊이 구획을하는 것입니다. 한 소마 구획 여섯 축삭 / glia 구획은 마이크로 밀링 머신 (MDX - 40, 롤랜드 또는 기타 CNC 밀링 머신)을 사용하여 PMMA 블록에 정의됩니다. PMMA 마스터는 다음 파편을 제거하는 10 분 동안 이소 프로필 알코올에 sonicated됩니다.
- 2.5 μm의 하이 리지 구조의 배열은 유리의 서부 유럽 표준시 에칭 다음 표준 석판술 프로세스에 의해 50.8 mm X 50.8 mm 유리 슬라이드에 패턴입니다.
첫째, 리지 구조의 배열 석판술를 사용하여 긍정적인 포토 레지스트 S1818과 함께 청소를 유리 기판에 패턴입니다. S1818은 110을 기반으로 부드러운 기판 (4000 RPM)에 스핀 - 코팅 ° 후 5 분 C 및 40 MF319에 포토 레지스트의 개발하여 다음 마스크 aligner를 사용하여 자외선 (84 MJ / cm 2)에 노출 초. 다음, 포토 레지스트 패턴 유리 기판은 2.5 μm의 톨 리지 구조를 얻기 위해 6-7분 위해 상온에서 산화 에칭 버퍼 (BOE)에 포장되어 있습니다. 마지막으로 포토 레지스트 층 드 이온화 (DI) 물에 ....
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토론
우리는 포유 동물 CNS 축삭 - glia 상호 작용을 연구를위한 다중 구획 공동 문화 플랫폼을 개발했습니다. CNS의 axons가 성공적으로 세포의 연결 기관 / dendrites과 격리되어 있었고, oligodendrocytes가 성공적으로 장치 내부에 공동 교양되었습니다. 신경 세포 밀도는 애플 리케이션에 의해 변경될 수 있지만, 너무 낮게 또는 너무 높은 농도는 세포가 죽는 원인이 될 수 있습니다. 또한, 기판의 셀 또는 axonal 레이어가 손상되지 않도록 문화 미디어의 절반 밖에를 변경하는 것이 중요합니다. 우리는이 시스템 CNS 축삭 - glia은 체외에서 네트워크 신호를 공부를위한 강력한 도구와 myelination와 myelin 복구를 촉진 심사 성장 요인 또는 잠재 약물 후보에 대한 높은 처리량 플랫폼을위한 경로를 제공하는 것으로 기대합니다.
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공개 사항
저자들은 공개할 이해관계가 없음을 밝힙니다.
감사의 글
이 작품은 정신 건강 보건 / 국립 연구소 (NIH / NIMH)의 국립 연구소 # 1R21MH085267을 부여하여 지원했다.
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참고문헌
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. 6, 683-690 (2005).
- Xia, Y., Whitesides, G. Soft Lithography. Angew. Chem. 37, 550-575 (1998).
- Taylor, A.
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재인쇄 및 허가
