Este vídeo-artigo descreve, passo a passo, como processar uma amostra de sêmen para alcançar boa qualidade de fluorescência<em> In situ</em> Hibridação em espermatozóides humanos. Preparações obtidas podem ser usadas para triagem aneuploidia no contexto do diagnóstico clínico.
Abstract
Aneuploidias são as anormalidades cromossômicas mais freqüentes em humanos. A maioria destas anormalidades resultam de erros durante o processo de meiose gametogénicas nos pais. Nos machos humanos, estes erros podem levar à produção de espermatozóides com anormalidades cromossômicas numéricas que representam um maior risco de transmissão destas anomalias à descendência.
Por esta razão, a técnica de hibridização fluorescente in situ (FISH) em núcleos espermáticos tornou-se um protocolo amplamente incorporada no contexto do diagnóstico clínico. Esta prática fornece uma estimativa das freqüências de anormalidades cromossômicas numéricas nos gametas dos pacientes que procuram para aconselhamento genético reprodutivo.
Até à data, os cromossomos mais freqüentemente incluídos na análise FISH espermatozóides são cromossomos X, Y, 13, 18 e 21.
Este vídeo-artigo descreve, passo a passo, como processar e fixar uma amostra de sêmen humano, como decondense e desnaturar a cromatina de espermatozóides, como proceder para obter preparações FISH esperma, e como visualizar os resultados no microscópio. Observações especiais dos passos mais relevantes são dadas para alcançar os melhores resultados.
Protocol
I. O processamento da amostra e fixação de células Deixe a amostra de sêmen em recipientes esterilizados em temperatura ambiente por 20 minutos até que a liquefação. Transferir a amostra para um tubo de centrífuga e girá-lo em 1000g por 5 minutos. Remova cuidadosamente e desprezar o sobrenadante com uma pipeta Pasteur. Adicionar solução hipotônica (KCl, 0.075M) pré-aquecido a 37 ° C, gota a gota, ao misturar em um vortex para obter um volume final de 10 ml. <li…
Discussion
Este protocolo descreve como processar amostras de sêmen humano para a obtenção de preparações FISH esperma. Usando este protocolo, é possível analisar anormalidades cromossômicas em gametas masculinos. Espermatozóides triagem aneuploidia tem aplicações tanto no contexto da pesquisa básica e no aconselhamento reprodutivo dado a homens inférteis. Embora no diagnóstico clínico dos cromossomos mais estudados são X, Y, 13, 18 e 21, outras sondas comerciais para uma vasta gama de cromossomos e loci estão dis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Os autores agradecem a J. Blanco e F. Vidal para a sua supervisão e encorajamento, e Lucas J. para a sua assistência técnica.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
1,4-Dithiothreitol (DTT)
Material
Roche
10197777001
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol
Material
Roche
10708976001
Acetic acid
Material
Merck
100.063
AneuVysion® Multicolor DNA Probe Kit
20xSaline-Sodium Citrate
4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI II)
CEP 18/X/Y DNA probe
NP-40
LSI 13/21 DNA probe
Material
Vysis Inc.
32-161075
30-805850
30-804941
30-171077
30-804820
30-171078
Centrifuge 5804R
Tool
Eppendorf
Centrifuge tube
Material
Nunc
347856
Coplin jar (glass)
Material
Barloworld Scientific
Hellendahl (ZCT278)
Coplin jar (plastic)
Material
Deltalab
191087
Cover slips (15×15)
Material
Knittel gläser
4600115
Cover slips (18×18)
Material
Knittel gläser
4600118
Diamond pencil
Material
Hammacher
335117010
Ethanol
Material
Merck
100.983
Formamide
Material
Roche
11814320001
Freezer
Tool
Zanussi
Gloves
Material
Sanyc
101/3300
HYBrite™
Tool
Vysis Inc.
Immersion Oil
Material
Olympus
35505
Incubator
Tool
Heraeus
Methanol
Material
Merck
106.009
Micropipette
Material
Labsystems
Finnpipette (4500000)
Micropipette replacement tip
Material
Daslab
16-2001
Nail varnish
Material
Quo-cosmetics
Olympus BX60 epifluorescence microscope
Tool
Olympus
Equipped with a triple-band filter for DAPI/Texas Red/FITC and single-band filters for Aqua, FITC and Texas Red.