Method Article

형광 현장에서 하이브리드화 (물고기) 프로토콜

DOI:

10.3791/1405

⸱

September 1st, 2009

 , 
1Unitat de Biologia Cel·lular (Facultat de Biociències), Universitat Autónoma de Barcelona

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 비디오 기사는 양질의 형광을 달성하기 위해 정액 샘플을 처리하는 방법을 단계적으로, 설명 현장에서 하이브 리다이 제이션. 얻은 준비는 임상 진단의 맥락에서 aneuploidy 심사 사용할 수 있습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aneuploidies은 인간에서 가장 자주 염색체 이상입니다. 이러한 이상의 대부분은 부모의 gametogenic 과정 meiotic 오류로 인한. 인간의 남성에서 이러한 오류가 자손에게 이러한 이례적인 전송의 증가 위험을 나타내는 수치 염색체 이상과 마리의 정자 수야의 생산으로 이어질 수 있습니다.

이러한 이유로, 정자의 핵에 원위치 하이브리드화 (물고기)의 형광의 기술은 광범위하게 임상 진단의 맥락에 통합 프로토콜되고있다. 이러한 행위는 유전자의 생식 조언을 추구 환자의 gametes의 수치 염색체 이상의 주파수의 예측을 제공합니다.

지금까지 대부분의 자주 정자 생선 분석에 포함된 염색체는 염색체 X, Y, 13, 18과 21입니다.

이 비디오 문서에서는 어떻게 현미경의 결과를 시각화하는 방법에 정자 물고기 준비를 얻기 위해 진행 정자 염색질을 decondense 및 변성하는 방법, 인간의 정액 샘플을 처리하고 해결하는 방법을 단계적으로, 그리고 설명합니다. 가장 관련성이 높은 단계의 특별 연설은 최상의 결과를 달성하기 위해 주어집니다.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I. 샘플 처리 및 세포 고정

  1. 액화까지 20 분 실온에서 멸균 용기에 정액 샘플을 둡니다.
  2. 원심 분리기 튜브에 샘플을 전송하고 5 분 1천그램에 그것을 돌린다.
  3. 부드럽게 파스퇴르 피펫을 사용하여 표면에 뜨는를 제거하고 폐기.
  4. hypotonic 솔루션을 추가 (KCl, 0.075M) 미리 가열 10 ML의 최종 볼륨을 얻기 위해 소용돌이에 혼합하는 동안, 37 ° C 드롭에 의해 드롭.
  5. 37 물 목욕에 튜브를 삽입 ° C를 30 분.
  6. 5 분 1천g에서 원심 분리기. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고, decantation로 뜨는 폐기하십시오.
  7. 8 ML의 최종 볼륨을 얻기 위해 소용돌이에 혼합하는 동안 드롭하여 드롭 : 펠렛을 resuspending 후, 갓 Carnoy의 정착액을 (초산 3시 1분 메탄올) 준비 추가할 수 있습니다.
  8. 흰색 펠렛을 얻기 위해 필요한만큼 여러 번 같은 점 6과 7을 반복합니다.
  9. 신선한 메탄올 추가 : 초산 (3시 1분) (작은 펠릿 분들의 경우 확산 좋은 세포를 얻는 데 필요한 세포 농도 최종 음량을 조절하기 위해 드롭하여 드롭을 몇 방울이 높은 양의 샘플 반면에 충분합니다 정자가 회복의 최종 볼륨) 1-....

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 정자 물고기 준비를위한 인간의 정액 샘플을 처리하는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 남성의 염색체 이상 gametes를 분석하는 것이 가능합니다. 마리의 정자 수야 aneuploidy 심사는 기초 연구의 맥락과 불임 남성에게 주어진 생식 조언에 두 응용 프로그램이 있습니다. 임상 진단에 가장 널리 연구 염색체는 X, Y, 13, 18 및 21 염색체와 loci 광범위한 다른 상용 프로브은 사용할 수 있으며, 이러한 실험에서도 사용할 수 있지만.

....

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 Generalitat 드 Catalunya (2005 - SGR00437)에 의해 지원되었다. 저자는 그들의 자신의 기술 지원에 대한 감독과 격려, 그리고 J. 루카스에 대한 J. 블랑코와 F. 비달에 감사드립니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-디티오트레이톨(DTT)재료Roche 그룹10197777001
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol재료Roche 그룹10708976001
아세트산재료Merck & Co., Inc.100.063
아뉴비시온® 다색 DNA 프로브 키트
  • 20xSaline-Sodium Citrate
  • 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI II)
  • CEP 18/X/Y DNA 조사
  • NP-40
  • LSI 13/21 DNA probe
MaterialVysis Inc.32-161075
  • 30-805850
  • 30-804941
  • 30-171077
  • 30-804820
  • 30-171078
Centrifuge 5804RToolEppendorf
Centrifuge tubeMaterialNalge Nunc international347856
Coplin jar (glass)MaterialBarloworld ScientificHellendahl (ZCT278)
Coplin jar (plastic)MaterialDeltalab191087
Cover slips (15x15)MaterialKnittel Glaser4600115
Cover slips (18x18)MaterialKnittel Glaser4600118
Diamond pencilMaterialHammacher335117010
Ethanol재료: Merck & Co., Inc.100.983
포름아미드재료Roche Group11814320001
냉동도구Zanussi
장갑재료Sanyo101/3300
HYBrite™도구Vysis Inc.
이멀젼 오일재료Olympus Corporation35505
인큐베이터도구Heraeus Instruments
메탄올재료Merck & Co., Inc.106.009
마이크로 피펫재료LabsystemsFinnpipette (4500000)
마이크로 피펫 교체 팁재료Daslab16-2001
네일 바니시재료Quo-cosmetics
Olympus BX60 epifluorescence microscopeToolOlympus CorporationDAPI/Texas Red/FITC용 삼중 대역 필터와 Aqua, FITC 및 Texas Red용 단일 대역 필터가 장착되어 있습니다.
파스퇴르 피펫재질: Rubilabor211.0230
위상차 현미경도구: Nikon Instruments
플라스틱 피펫 (3ml):재질 : Deltalab200007
염화칼륨 (KCl)재질: Fluka60128
고무 시멘트재질: 최고의 테스트
슬라이드재질Knittel Glaser4520022
Slide Saver Boxes재질Deltalab19276.1
멸균 용기재질Deltalab409726
주사기재질PentaFerte002022300
온도계재질Comark Instruments, IncKM12
삼중 증류수재질
Triton X-100재질Sigma-Aldrich9002-93-1
핀셋재질B. Braun MedicalAesculap (BD224R)
수직 층류 flow hoodToolBurdinolaOR-ST 1500
Vortex mixerToolFisher ScientificFB15012
수조도구Raypa®

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization. Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).
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