קבלת מטוהרים Toxoplasma gondii שביצים ידי Gradient כלוריד רציפה וצזיום

Summary

מחקר זה מתאר את התפתחות שיטת CsCl שונה בקלות מטהר ט שביצים gondii מצואה של חתולים נגועים המתאימים ביולוגית מולקולרית תרבות מניפולציה רקמה

Abstract

Toxoplasma gondii הוא הפתוגן לחייב protozoan תאיים כי בדרך כלל מדביק בני אדם. זהו apicomplexan מאופיין היטב הקשורים בגרימת מזון ומים נישאים להתפרצות מחלות. המארח הוא סופי מינים של חתולים היכן שכפול מינית מתרחשת וכתוצאה מכך להתפתחות oocyst מדבקת מאוד עמיד לסביבה. ההדבקה מתרחשת באמצעות בליעה של ציסטות רקמה בשר או שביצים מזוהם מן האדמה או מים. הזיהום הוא בדרך כלל ללא תסמינים אצל אנשים בריאים, אבל התוצאה היא זיהום לאורך החיים סמוי כי ניתן להפעיל מחדש את דלקת קרום המוח ולגרום למוות toxoplasmic ואם הפרט הופך immunocompromised. בשר מזוהם עם ט ' ציסטות gondii היו המקור העיקרי לזיהום באירופה וארצות הברית, אבל השינויים האחרונים בהנהלת חיה ושיטות חקלאות וטיפול מזון משופר ונהלים עיבוד צמצמו משמעותית את שכיחות ט gondii ציסטות ^{1 בשר, 2.} עם זאת, seroprevalence בבני אדם נותר גבוה יחסית שמראה כי חשיפה מהקרקע מים מזוהמים oocyst או סביר. ואכן, התפרצויות waterborne של טוקסופלזמוזיס דווחו ברחבי העולם התומכים בתיאוריה חשיפה לטופס oocyst הסביבה מהווה סיכון בריאותי משמעותי ^3-5. מחקר כה, על הבנה השכיחות של ט ' שביצים gondii במים ואיכות הסביבה מוגבלים בשל העדר של כלים לגילוי שביצים בסביבה ^{5, 6.} זה בעיקר בשל היעדר פרוטוקולים טיהור יעיל להשגת מספר גדול של מטוהרים מאוד T שביצים gondii מחתולים נגועים למטרות מחקר. מחקר זה מתאר את התפתחות שיטת CsCl שונה בקלות מטהר ט gondii שביצים מצואה של חתולים נגועים המתאימים ביולוגית מולקולרית בתרבית רקמה מניפולציה ^7.

Protocol

<p class="jove_title"> 1. כללי בטיחות זהירות כאשר עובדים עם<em> ט gondii</em> שביצים</p><ol><li> חשוב לעקוב אחרי כל אמצעי בטיחות כאשר עובדים עם<em> ט gondii</em> שביצים. אצל אנשים בריאים ביותר,<em> ט gondii</emזיהום> נשלט בקלות על ידי המערכת החיסונית, אך חיים ארוכים תוצאות זיהום. אנשים immunocompromised רגישים במיוחד טוקסופלזמוזיס ולא צריך לטפל<em> ט gondii</em> שביצים. נשים בהריון צריכות גם לא לטפל<em> ט gondii</em> שביצים, כי הזיהום עלול לגרום למומים מולדים חמורים⁸.</li><li<em> ט gondii</em> שביצים צריך רק להיות מטופלים בשטח המיועד עם צוות מיומן. סימנים המעידים<em> ט gondii</em> עבודה oocyst מתבצעת חייב להתפרסם כדי להתריע אחרים להיכנס אל תוך השטח המיועד.</li><li> ללבוש מתאים ציוד מגן אישי (PPE) כגון חלוק מעבדה, חלוק חד פעמי, כפפות חד פעמיות, והגנה עין תקין או מגן פנים בעת הטיפול<em> ט gondii</em> שביצים.</li><li> שינויים תכופים כפפה מומלץ. לא להתמודד עם כל ציוד מעבדה עם<em> ט gondii</em> Oocyst מזוהמים כפפות.</li><li> השתמש תמיד מגשי מתכת מצופה autoclavable ספינות סופג חד פעמי כאשר עובדים עם<em> ט gondii</em> שביצים. ודאו כי כל המדפים, צינורות, וכו 'משמש הן חד פעמיות או autoclavable.</li><li> כל<em> ט gondii</emפסולת> יש autoclaved פעמיים במשך שעה אחת לפחות.</li><li> כל הציוד הלא מתכלה (מתלים, מגשים וכו ') חייב להיות גם autoclaved פעמיים במשך שעה אחת לפחות.</li><li> קווי אבק רגיל לשאוב נוזלים צריך להיות מחובר ™ Vacushield לסנן על מנת למנוע זיהום של משאבת ואקום.</li><li> כל מעבדה מושפע הספסל צמרות יש לחטא לאחר שסיים לעבוד עם<em> ט gondii</em> שביצים. Hypochlorite 10% עשו טרי צריך להיות מיושם בנדיבות על אזור העבודה ואפשרו יבש. האזור לאחר מכן יש לשטוף היטב עם מים.</li></ol><p class="jove_title"> 2. הכנת מאגרים ופתרונות</p><ol><li> הכן 1 2.2 L M פתרון של סוכרוז על ידי המסת 752.66 גרם של סוכרוז ב 600 מ"ל DDH₂ א ' מערבבים ומחממים בעדינות בעזרת צלחת ומערבבים מחומם לפזר את סוכרוז. לאחר נמס לגמרי, להביא נפח L 1 עם DDH₂ א ' זו צריכה להיות מלווה על ידי עיקור מעוקר הפתרון לפחות 20 דקות.</li><li> הכן TE 1L חיץ (50 mM טריס-HCl, 10 mM EDTA), pH 7.2 ידי הוספת 6.05 גרם של טריס-HCl ו 3.7 גרם של EDTA ב 700 מ"ל של DDH₂ O, כדי להתאים את ה-pH 7.2 אז להביא נפח L 1 עם DDH₂ א '</li><li> עבור השיפוע CsCl, להכין מלאי של פתרון CsCl בחומרה ספציפית של 1.15 (1.15-CsCl) על ידי הוספת 21.75 גרם CsCl עם 103.25 מ"ל של הצפת TE. פתרון, לערבב 30 מ"ל של TE עם 20 מ"ל של 1.15-CsCl. פתרון ב ', לערבב 20 מ"ל של TE עם 30 מ"ל של 1.15-ו 12.5 CsCl μl של פתרון פנול אדום. פתרון C, לערבב 10 מ"ל של TE עם 40 מ"ל של 1.15-CsCl (טבלה 1).</li><li> הכן פתרון 1 ליטר 1 N של סודיום הידרוקסיד (NaOH) על ידי המסת 40 גרם של NaOH, ב 800 מ"ל של DDH₂ א ' מומס פעם, להביא נפח L 1 עם DDH₂ א '</li><li> הכן פתרון 1 ל 2% (לפי נפח) של H₂ SO₄ ערבוב 20 מ"ל של H₂ SO₄ עם 980 מ"ל של DDH₂ א '</li></ol><p class="jove_title"> 3. סוכרוז לצוף</p><ol><li> הוסף 10 מ"ל של השעיה של צואה<em> ט gondii</em> שביצים, ב 2% H₂ SO₄, לתוך צינור מ"ל 50 צנטריפוגות חרוטי. יש לציין כי ההשעיה צואה מתייחס דוגמאות, כי כבר מראש מעובד באמצעות הליך הנפקה סוכרוז כפי שתואר קודם לכן⁸. כאשר דגימות צואה נקצרים בתחילה מן החתולים הנגועים הם מעובדים באמצעות לצוף סוכרוז כפי שתואר התייחסות 8. זה לצוף סוכרוז נוסף יש צורך לצמצם עוד יותר פסולת צואה נישא מעל לתהליך טיהור CsCl ולקבל הטהור<em> ט gondii</em> שביצים אפשרי.</li><li> לנטרל את H 2%₂ SO₄ על ידי הוספת 6 מ"ל (3 / 5 כרכים) של 1 N NaOH על ההשעיה צואה. מערבבים היטב על ידי vortexing.</li><li> הוסף נפח זהה (16 מ"ל) של סוכרוז 2.2 M יצירת הריכוז הסופי של M 1.1 על ההשעיה צואה ומערבבים היטב על ידי vortexing.</li><li> בזהירות כיסוי סוכרוז / השעיה צואה עם 10 מ"ל DDH₂ O בעזרת פיפטה 10 מ"ל. צנטריפוגה ההשעיה XG ב 1200 עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר עם הבלם לא.</li><li> לאסוף בזהירות את המים מעל שכבות שלבי הביניים והעברת צינור חדש מ"ל 50 צנטריפוגות חרוטי ידי pipetting מממשק האוויר המים בלי מתערבל פיפטה. חשוב למזער שריד סוכרוז תוך איסוף שכבת שלבי הביניים.</li><li> מערבבים את שאר סוכרוז / צואה פתרון גלולה ידי vortexing את הצינורית.</li><liחזור> צעדים 3.4 ו 3.5.</li><li> הביאו את עוצמת הקול של שני הפתרונות שלבי הביניים oocyst ל 50 מ"ל עם DDH₂ O ו צנטריפוגות צינורות XG ב 2000 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li><li> לשאוב supernatant מהצינור כל כדורי resuspend עם חיץ TE 5 מ"ל ו – הבריכה ההשעיה oocyst יחד. נפח ונקווה הכולל צריך להיות 10 מ"ל.</li></ol><p class="jove_title"> 4. CsCl שיפוע</p><ol><li> הכן שיפוע CsCl רציפה בתוך שפופרת 50 מ"ל באוקרידג' פוליקרבונט ידי בקפידה underlaying כל שכבה באמצעות מזרק 50 מ"ל עם מד 18 קהה הסתיים, autoclavable, מחט פלדה, זין דרך לעצור 2. הערה: פנול אדום הוא הוסיף B פתרון להבחין בקלות בין שכבות צבע (לוח 1).</li><li> לאט לאט להוסיף את הפתרונות הבאים אל הצינור כדי המפורטים להלן. יצוין כי קצב הזרימה לא יעלה יותר מ 0.5 מ"ל / sec.<ol><li> 10 מ"ל של מדגם TE / oocyst ההשעיה</li><li> 8 מ"ל פתרון</li><li> 8 מ"ל פתרון B</li><li> 8 מ"ל פתרון C</li></ol></li><li> צנטריפוגה הצינור באוק רידג' בשעה XG 12,000 עבור 60 דקות ב 4 ° C עם הבלם לא. השימוש הרוטור זווית קבועה מקובל, אבל במהירות גבוהה מתנדנד תוצאות דלי בהפרדה טובה יותר של שביצים מן המדגם ההשעיה עם מינימלי מריחות פסולת צואה לאורך הצד או את הצינורית. היקף כתמי תלוי בהרכב ההשעיה צואה ועל כן עשוי להיות נחוץ כדי לבצע שתי gradients CsCl אם ההשעיה צואה מלוכלך מאוד.</li><li> בעקבות צנטריפוגה, ולאסוף את הלהקה אטום / לבן oocyst המכיל בין פתרונות A ו-B כדי למזער זיהום בפסולת צואה, לעבור ישירות הלהקה oocyst מבלי להפריע שיפוע לאסוף את שלבי הביניים oocyst בעזרת פיפטה 10 מ"ל. מעבירים את שלבי הביניים oocyst אל צינור חדש מ"ל 50 צנטריפוגות חרוטי. נסו לצמצם את כמות פתרון CsCl aspirated תוך איסוף oocyst שלבי הביניים מכיוון שהוא עלול להוות בעיה pelleting שביצים במהלך שלב ההדחה.</li><li> לשטוף שביצים עם 30-40 מ"ל של DDH₂ א ' צנטריפוגה התחתית XG 2000 בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות עם הבלם לא. בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע גלולה oocyst. חזור על לשטוף 2 פעמים נוספות.</li><li> בסוף לשטוף הסופי, בזהירות לשאוב supernatant ו resuspend את הכדור בתוך חומצה גופרתית 10 מ"ל 2% ולאחסן ב 4 ° C עד השימוש. שביצים מוכנים כעת עבור מניפולציה נוספת. טוהר Oocyst ניתן לבדוק במיקרוסקופ על ידי בהעדר פסולת צואה במדגם.</li></ol>