Obtenção altamente purificada Toxoplasma gondii Oocistos por um gradiente de cloreto de césio descontínuos

Summary

Este estudo descreve o desenvolvimento de um método modificado CsCl que facilmente purifica oocistos T. gondii a partir de fezes de gatos infectados que são adequados para biológica molecular e manipulação de cultura de tecidos

Abstract

Toxoplasma gondii é um protozoário patógeno intracelular obrigatório que normalmente infecta seres humanos. É um apicomplexan bem caracterizado associados a causar surtos de doenças alimentares e transmitidas pela água. O hospedeiro definitivo é a espécie de felino, onde ocorre a replicação sexual resultando no desenvolvimento do oocisto altamente infecciosa e ambientalmente resistente. A infecção ocorre através da ingestão de cistos de tecido de carne contaminada ou oocistos do solo ou água. Infecção é geralmente assintomática em indivíduos saudáveis, mas resulta em uma infecção latente ao longo da vida que pode reativar causando encefalite toxoplásmica e morte se o indivíduo torna-se imunocomprometidos. Carne contaminada com T. cistos gondii têm sido a principal fonte de infecção na Europa e nos Estados Unidos, mas as recentes mudanças na gestão animal e práticas de criação e manipulação de alimentos melhorados e procedimentos de processamento reduziram significativamente a prevalência de T. cistos gondii em carne ^{1, 2.} No entanto, a seroprevalência em humanos permanece relativamente elevada, sugerindo que a exposição a partir de solo contaminado de oocistos ou água é provável. De fato, os surtos pela água da toxoplasmose foram relatados em todo o mundo apoiando a exposição teoria para a forma de oocistos ambiental representa um risco significativo de saúde ^3-5. A pesquisa data, no entendimento da prevalência de T. gondii oocistos na água e meio ambiente são limitados devido à falta de ferramentas para detecção de oocistos no ambiente ^{5, 6.} Isto é principalmente devido à falta de protocolos de purificação eficientes para a obtenção de um grande número de oocistos altamente purificada T gondii de gatos infectados para fins de pesquisa. Este estudo descreve o desenvolvimento de um método modificado CsCl que facilmente purifica T. gondii oocistos de fezes de gatos infectados que são adequados para biológica molecular e manipulação de cultura de tecidos ^7.

Protocol

<p class="jove_title"> 1. Geral precauções de segurança quando se trabalha com<em> T. gondii</em> Oocistos</p><ol><li> É importante seguir todas as precauções de segurança quando se trabalha com<em> T. gondii</em> Oocistos. Na maioria dos indivíduos saudáveis,<em> T. gondii</emInfecção> é facilmente controlado pelo sistema imunológico, no entanto, um resultado ao longo da vida a infecção. Indivíduos imunocomprometidos são particularmente suscetíveis à toxoplasmose e não deve lidar com<em> T. gondii</em> Oocistos. Mulheres grávidas também não devem lidar com<em> T. gondii</em> Oocistos, porque a infecção pode causar defeitos congênitos graves⁸.</li><li<em> T. gondii</em> Oocistos só deve ser manipulado em uma área designada e com pessoal treinado. Sinais indicando<em> T. gondii</em> Trabalho de oocistos está em andamento deve ser enviada para alertar outras pessoas de entrar na área designada.</li><li> Use equipamento de protecção individual (EPI), tais como jaleco, vestido descartável, luvas descartáveis ​​e óculos de protecção adequada ou uma viseira ao manusear<em> T. gondii</em> Oocistos.</li><li> Mudanças freqüentes de luvas são recomendados. Não manuseie nenhum equipamento de laboratório com<em> T. gondii</em> Oocisto contaminados luvas.</li><li> Sempre use bandejas de metal revestidas com uma autoclave forros descartáveis ​​absorventes quando se trabalha com<em> T. gondii</em> Oocistos. Garantir que todos os racks, tubos, etc utilizados são descartáveis ​​ou autoclaváveis.</li><li> Todos os<em> T. gondii</emResíduos> deve ser autoclavado duas vezes para pelo menos uma hora.</li><li> Todos os equipamentos não descartáveis ​​(racks, bandejas, etc) também devem ser autoclavados duas vezes para pelo menos uma hora.</li><li> Linhas de vácuo utilizado para aspirar líquidos deve ser conectado a um filtro de Vacushield ™ para evitar a contaminação da bomba de vácuo.</li><li> Todos os afetados bancada de laboratório-tops devem ser desinfectados após completar o trabalho com<em> T. gondii</em> Oocistos. Acabado de fazer hipoclorito de 10% deve ser aplicada liberalmente para a área de trabalho e permitiu seco. A área deve ser bem lavado com água.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Preparação de tampões e soluções</p><ol><li> Prepare uma solução de 1 L de sacarose 2,2 M, dissolvendo 752,66 g de sacarose em 600 ml DDH₂ O. Mexa delicadamente e calor usando uma placa aquecida mexa para dissolver a sacarose. Uma vez completamente dissolvido, trazer volume de 1 L com DDH₂ O. Isto deve ser seguido por esterilização em autoclave a solução para pelo menos 20 minutos.</li><li> Prepare um 1L tampão TE (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA), pH 7,2 pela adição de 6,05 g de Tris-HCl e 3,7 g de EDTA em 700 ml de DDH₂ O, ajustar o pH para 7,2, em seguida, levar o volume para 1 L com DDH₂ O.</li><li> Para o gradiente de CsCl, prepare uma solução estoque de CsCl com uma gravidade específica de 1,15 (1,15-CsCl), adicionando 21,75 g de CsCl com 103,25 ml de tampão TE. Solução A, misture 30 ml de TE com 20 ml de 1,15-CsCl. Solução B, misturar 20 ml de TE com 30 ml de 1,15-CsCl e 12,5 ml de solução de vermelho de fenol. Solução para C, misturar 10 ml de TE com 40 ml de 1,15-CsCl (Tabela 1).</li><li> Prepare uma solução de 1L 1 N de hidróxido de sódio (NaOH) pela dissolução de 40 g de NaOH, em 800 ml de DDH₂ O. Uma vez dissolvido, levar o volume para 1 L com DDH₂ O.</li><li> Prepare uma solução de L 1 a 2% (por volume) de H₂ SO₄ 20 ml de mistura de H₂ SO₄ Com 980 ml de DDH₂ O.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Flutuar sacarose</p><ol><li> Adicionar 10 ml de uma suspensão fecal de<em> T. gondii</em> Oocistos, em 2% H₂ SO₄, Em um tubo de centrífuga de 50 ml. Deve-se notar que a suspensão fecal refere-se a amostras que foram pré-processadas através de um procedimento de flotação de sacarose, como descrito anteriormente⁸. Quando as amostras fecais são inicialmente colhidos os gatos infectados são processados ​​através de uma bóia de sacarose, como descrito na referência 8. Este flutuar sacarose adicional é necessário para minimizar ainda mais os restos fecais transitar para o processo de purificação CsCl e obter a mais pura<em> T. gondii</em> Oocistos possível.</li><li> Neutralize o H 2%₂ SO₄ Adicionando 6 ml (3 / 5 volumes) de 1 N de NaOH para a suspensão fecal. Misture bem em vórtice.</li><li> Adicionar um volume igual (16 ml) de 2,2 M de sacarose a criação de uma concentração final de 1,1 M à suspensão fecal e misturar bem em vórtice.</li><li> Cuidadosamente sobrepor a sacarose / suspensão fecal com 10 ml DDH₂ O usando uma pipeta 10 ml. Centrifugar a suspensão a 1.200 xg por 20 min em temperatura ambiente sem freio.</li><li> Cuidadosamente recolher a água superior e camadas interfase e transferir para um novo tubo de 50 ml de centrífuga cônico pipetando a partir da interface ar-água, sem roda da pipeta. É importante para minimizar a transição de sacarose ao coletar a camada de interfase.</li><li> Misture o restante sacarose / solução pelota fecal em vortex do tubo.</li><li> Repetir os passos 3.4 e 3.5.</li><li> Trazer o volume das duas soluções interfase oocisto a 50 ml com DDH₂ O e centrifugar os tubos a 2000 xg por 10 minutos em temperatura ambiente.</li><li> Aspirar o sobrenadante de cada tubo e ressuspender pellets com 5 ml tampão TE e piscina a suspensão de oocistos juntos. O volume total agrupada deverá ser de 10 ml.</li></ol><p class="jove_title"> 4. CsCl gradiente</p><ol><li> Prepare um gradiente de CsCl descontínua em um tubo de policarbonato de 50 ml de Oak Ridge com cuidado underlaying cada camada usando uma seringa de 50 ml com uma calibre 18 ponta e, autoclavável, agulha de aço, e uma torneira de 2 vias. Nota: vermelho de fenol é adicionado à solução B para distinguir facilmente entre as camadas de gradiente (Tabela 1).</li><li> Aos poucos adicione as seguintes soluções para o tubo na ordem listada abaixo. Note-se que a taxa de fluxo não deve exceder mais de 0,5 ml / seg.<ol><li> 10 ml da amostra de suspensão TE / oocistos</li><li> Solução ml 8 A</li><li> 8 ml da solução B</li><li> 8 ml da solução C</li></ol></li><li> Centrifugue o tubo de Oak Ridge a 12.000 xg por 60 min a 4 ° C, sem freio. Uso de um rotor ângulo fixo é aceitável, mas uma alta velocidade balançando resultados balde em uma melhor separação dos oocistos a partir da amostra de suspensão com o mínimo de manchas de detritos fecais ao longo do lado ou do tubo. A extensão das manchas depende da composição da suspensão fecal e, portanto, pode ser necessário para executar dois gradientes CsCl se a suspensão fecal é extremamente sujo.</li><li> Após a centrifugação, recolher a banda de oocistos opaco / branco contendo entre as soluções A e B. Para minimizar a contaminação com detritos fecais, vá diretamente para a banda de oocistos sem perturbar o gradiente e recolher a interfase oocisto usando uma pipeta 10 ml. Transferir o oocisto interfase para um 50 ml novo tubo de centrífuga cônico. Tentar minimizar a quantidade de solução de CsCl aspirado ao coletar o oocisto interfase, uma vez que pode representar um problema na granulação dos oocistos durante a etapa de lavagem.</li><li> Lave oocistos com 30-40 ml de DDH₂ O. Centrifugar o tubo em 2.000 xg à temperatura ambiente por 10 min sem freio. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento de oocistos. Repetir a lavagem duas vezes.</li><li> No final da lavagem final, aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de ácido sulfúrico 2% e armazenar a 4 ° C até o uso. Oocistos está agora pronto para manipulação posterior. Pureza de oocistos pode ser verificada microscopicamente pela ausência de detritos fecais na amostra.</li></ol>