Labeling fluorescentes de Drosophila Estruturas Coração
Summary
Aqui nós descrevemos um protocolo básico para a rotulagem fluorescentes de diferentes elementos de tubos de coração de larva e adulto<em> Drosophila melanogaster</em>. Estas amostras são bem adaptados para geração de imagens através de microscopia fluorescente ou confocal. Essa técnica permite a análise estrutural detalhada das características dos corações de um organismo modelo poderoso.
Abstract
O<em> Drosophila melanogaster</em> Embarcação dorsal, ou coração, é uma estrutura tubular composta de uma única camada de cardiomiócitos contrátil, as células do pericárdio que se alinham ao longo de cada lado da parede do coração, músculos Alary de apoio e, em adultos, uma camada de células musculares longitudinal ventral. A casa fibras contrátil conservados constituintes da citoarquitetura muscular, incluindo feixes de miofibrilas densamente e complexos de proteínas do citoesqueleto / submembranas, que interagem com homólogos componentes da matriz extracelular. Aqui nós descrevemos um protocolo para a fixação e à rotulagem de determinados elementos fluorescentes do miocárdio do coração de larvas dissecadas e semi-intactas de adultos<em> Drosophila</em>. Especificamente, nós demonstramos a rotulagem de sarcômero F-actina e α-actinina nos corações larval. Além disso, realizamos rotulagem de F-actina e α-actinina em miosina-GFP expressar moscas adultas e de α-actinina e pericardin, um colágeno tipo IV matriz extracelular, no coração do adulto tipo selvagem. É dada especial atenção a uma estratégia de montagem para os corações semi-intactas de adultos que minimiza a manipulação e otimiza a oportunidade para manter a integridade dos tubos e os tecidos cardíacos associados. Estas preparações são adequadas para geração de imagens através de microscopia de fluorescência e confocal. No geral, este procedimento permite a análise cuidadosa e detalhada das características estruturais do coração de um sistema poderoso modelo geneticamente tratável.
Protocol
Discussion
Aqui apresentamos um protocolo útil para preparar e coloração da Drosophila melanogaster vaso dorsal e dos tecidos adjacentes para geração de imagens através de microscopia fluorescente ou confocal. Nós fornecemos um relato conciso dos passos refinado por e comumente empregado em nosso laboratório para a coloração eficaz que permite a bem-resolvido em imagens in situ de larvas e tubos coração adulto Drosophila. Outros descreveram métodos similares de forma abreviada …
Acknowledgements
Os autores agradecem SI Bernstein (San Diego State University) para a leitura crítica e sugestões úteis sobre a preparação deste manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo NIH concede a SI Bernstein, SDSU, e de R. Bodmer, BIMR, e por uma bolsa de pós-doutorado da filial dos Estados do Oeste da Associação Americana do Coração para G. Vogler e A. Cammarato.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ethylene glycol-bis (2-amino-ethylether) -N,N,N’,N’-tetra-acetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma-Aldrich® | E4378 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Reagent | Polysciences Inc. | 50-00-0 | |
| Triton-X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich® | 9002-93-1 | |
| Alexa Fluor® 594 phalloidin | Reagent | Invitrogen™ | A12381 | |
| Vectashield® Mounting Medium for Fluorescence with DAPI | Reagent | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| Tungsten pins | Reagent | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pin holder | Reagent | Fine Science Tools | 26018-17 |
References
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