Флуоресцентная маркировка Drosophila Структур сердца
Summary
Здесь мы опишем основные протокол для флуоресцентной маркировки различных элементов сердце труб из личинки и взрослых<em> Дрозофилы</em>. Эти образцы хорошо подходят для работы с изображениями с помощью люминесцентных или конфокальной микроскопии. Эта техника позволяет детальный структурный анализ особенностей сердца от могучий организм модели.
Abstract
<em> Дрозофилы</em> Спинной сосуд, или сердце, является трубчатая структура состоит из одного слоя сократительные кардиомиоциты, клетки, перикарда выровнять вдоль каждой стороны сердечной стенки, поддерживающие мышцы крыловидный и у взрослых, слой вентральных продольных мышечных клеток. Сократительной дом волокна сохраняется составляющих мышцу cytoarchitecture включая плотно упакованных пучков миофибрилл и цитоскелета / submembranous белковых комплексов, которые взаимодействуют с гомологичными компонентов внеклеточного матрикса. Здесь мы опишем протокол для фиксации и флуоресцентные маркировки частности инфаркта элементы из сердца расчлененный личинок и полу-нетронутыми взрослых<em> Drosophila</em>. В частности, мы демонстрируем маркировки саркомерных F-актин и α-актинина в личиночной сердца. Кроме того, мы выполняем маркировка F-актин и α-актинина в миозина-GFP выражения взрослых мух и α-актинина и pericardin, тип IV внеклеточной коллагеновой матрицы, в диких сердцем взрослого типа. Особое внимание уделяется установке стратегии для полу-нетронутыми сердца взрослых, которая минимизирует обработку и оптимизирует возможности для сохранения целостности сердечной трубки и связанных тканей. Эти препараты предназначены для работы с изображениями с помощью флуоресцентной и конфокальной микроскопии. В целом, эта процедура позволяет тщательный и подробный анализ структурных характеристик сердца от мощного генетически послушный модели системы.
Protocol
Discussion
Здесь мы приводим протокол полезно для подготовки и окраски спинной дрозофилы судна и связанные с ними тканей для работы с изображениями с помощью люминесцентных или конфокальной микроскопии. Мы предоставляем краткий отчет о шагах уточнены и обычно используются в нашей лаборато…
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность С. И. Бернштейн (San Diego State University) за критическое прочтение и полезные предложения по подготовке этой рукописи. Эта работа была поддержана грантами NIH С. И. Бернштейн, СДСУ и Р. Бодмер, BIMR; и пост-докторские стипендии с партнерской западных государств Американской ассоциации сердца к Г. Фоглер и А. Cammarato.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ethylene glycol-bis (2-amino-ethylether) -N,N,N’,N’-tetra-acetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma-Aldrich® | E4378 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Reagent | Polysciences Inc. | 50-00-0 | |
| Triton-X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich® | 9002-93-1 | |
| Alexa Fluor® 594 phalloidin | Reagent | Invitrogen™ | A12381 | |
| Vectashield® Mounting Medium for Fluorescence with DAPI | Reagent | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| Tungsten pins | Reagent | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pin holder | Reagent | Fine Science Tools | 26018-17 |
References
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. , (2009).
- Molina, M. R., Cripps, R. M. Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech Dev. 1, 51-59 (2001).
- Dulcis, D., Levine, R. B. Glutamatergic innervation of the heart initiates retrograde contractions in adult Drosophila melanogaster. J Neurosci. 2, 271-280 (2005).
- Zeitouni, B. Signalling pathways involved in adult heart formation revealed by gene expression profiling in Drosophila. PLoS Genet. 10, 1907-1921 (2007).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological change. J. Morphol. 2, 351-399 (1936).
- Miller, A. . The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. , (1950).
- Rizki, T. M. The circulatory system and associated cells and tissues. , (1978).
- Cammarato, A. Myosin transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles. Mol Biol Cell. 2, 553-562 (2008).
- Taghli-Lamallem, O. Dystrophin deficiency in Drosophila reduces lifespan and causes a dilated cardiomyopathy phenotype. Aging Cell. 2, 237-249 (2008).
- Kelso, R. J. a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 32, D418-D420 (2004).
- Dietzl, G. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 7150, 151-156 (2007).
- Mery, A. The Drosophila muscle LIM protein, Mlp84B, is essential for cardiac function. J Exp Biol. 211, 15-23 (2008).
