유전자 microarrays는 게놈 전체의 수준에서 유전자 발현 프로 파일링에 강력한 도구입니다. 이 기술은 발달 생물학 및 독성학을 포함한 생물 학적 다양한 분야에 응용 프로그램을하고 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 세부 zebrafish에 대한 포괄적인 oligonucleotide microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석을위한 프로토콜을.
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방법 논문
Zebrafish Oligonucleotide Microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석
이 논문에서
요약
초록
진 microarray 기술은 게놈 전체의 기준으로 명시 수준의 양적 측정과 유전자 발현 프로 파일링을 수 있습니다. 유전자 microarray 기술은 질병 상태로 발달 단계와 관련하여 세계적인 유전자 발현 분석을 포함한 다양한 응용 프로그램에서 다양한 생물 학적 분야에 사용하고, 독성 반응 인치입니다 여기에, 우리는 포괄적인 zebrafish 특정 oligonucleotide microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석의 데모를 포함합니다. zebrafish의 표현 microarray 플랫폼은 목표 당 12 프로브까지와 37,157 목표를 심문 385,000 프로브, 길이 60 기본 쌍을 포함하고 있습니다. 이 플랫폼은 zebrafish에 대해 사용할 수있는 모든 cDNA 및 게놈 정보는 Ensembl (http://www.ensembl.org), 베가 (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (포함한 다양한 게놈 데이터베이스에서 수집되었습니다 http://genome.ucsc.edu) 및 ZFIN (http://www.zfin.org). 결과적으로이 표현 배열은 현재 zebrafish의 transcriptome의 완전한 혜택을받을 수 있습니다. zebrafish의 표현 microarray는 로체 NimbleGen (매디슨, WI)에 의해 인쇄되었다. 이 기술 데모는 형광 cDNA 제품의 라벨, microarray 플랫폼에 표시된 제품의 cDNA 하이브 리다이 제이션, 그리고 한 색상 분석 전략을 사용하여 신호 획득을위한 배열 검사를 포함합니다.
프로토콜
1 부 : cDNA의 형광 라벨링
microarray 실험에 사용된 Cy3 염료는 사진 저하에 민감합니다. 절차는 빛의 최소한의 자리를 차지할 것입니다. 라벨 프로토콜은 BioPrime 배열 CGH의 게놈 라벨 시스템 매뉴얼 1 적응했다.
- 라벨 반응에 대한 시약은 -20 ° C.에 저장됩니다 BioPrime 배열 CGH의 게놈의 라벨링 시스템 해동 2.5X 랜덤 프리머 버퍼, 10X dCTP 믹스, 그리고 nuclease없는 물. 또한 Cy3 - dCTP 염료를 녹여. 해동 후, 간단히 사용하기 전에 모든 시약을 원심 분리기.
- 별도의 레이블 반응 분석 각 cDNA 샘플에 대해 완료해야합니다. 0.6 ML 두꺼운 벽으로 둘러싸인 튜브에 86 μl의 총 볼륨을 달성하기 위해 cDNA 500 NG, 40 μl 2.5X 랜덤 프리머 버퍼와 nuclease없는 물을 추가합니다.
- 잘 믹스하고 짧게 원심 분리기. 100 5 분 반응 ° thermocycler에서 C를 품어.
- 즉시 10 분 동안 얼음 목욕 슬러리에 반응을 전송합니다.
- 각각의 튜브하려면 다음 10 μl 10X dCTP 믹스, 2 μl 1 ㎜ Cy3 - dCTP와 2 μl의 DNA....
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토론
여기에 자세한 사람 등 많은 microarray 프로토콜은 하이브 리다이 제이션을 측정하고 quantifying의 수단으로 형광 염료를 사용합니다. Cy3 형광 염료는 사진 및 오존 파괴에 민감합니다. 이것은 프로 시저가 최소한의 조명을 실시하는 것이 좋습니다. 또한, 작은 먼지 입자는 하이브 리다이 제이션 및 스캔을 방해할 수 있습니다. 특별한주의는 작업 지역 깨끗하고 먼지에서 무료로 있는지 확인하기 위해 제공해야합니다.
이 절차에서 설명하는 라벨 프로토콜 많은 대안이 있습니다. 이것은 다양한 라벨 프로토콜은 각 특정 표현 microarray 플랫폼을위한 최적의 분류 절차를 확인하기 위해 테스트하는 것이 좋습니다. 절차 여기서 보여주는 로체 NimbleGen에 의해 인쇄된 특정 표현 어레이 플랫폼에 최적화되었습니다. 또한, 우리는 똑같이뿐만 아니라 일할 수있는 로체 NimbleGen 어레이 사용자 안내서에 설명된 상표 프로토콜을 발견했다. 하이브 리다이 제이션 속성 크게 플.......
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 어레이 마이크로원심분리기 건조기 | ISC Bioexpress | C-1303-T | |
| BioPrime Array CGH 게놈 표지 시스템 | Invitrogen | 18095-011 | |
| Cyanine 3-dCTP | PerkinElmer, Inc. | NEL576 | |
| GenePix 4000B | Molecular Devices | GENEPIX 4000B | |
| Microcon YM-30 | EMD Millipore | 42411 | |
| NimbleGen 어레이 처리 액세서리 | Roche Group | 5223539001 | |
| NimbleGen 하이브리다이제이션 키트 | Roche Group | 5223474001 | |
| NimbleGen 하이브리다이제이션 시스템 4 | Roche Group | 5223652001 | |
| NimbleGen 세척 완충액 키트 | Roche Group | 5223504001 | |
| X1 믹서 | Roche Group | 5223725001 |
참고문헌
- BioPrime Array CGH Genomic Labeling System Manual. , Version C. (2004).
- Roche NimbleGen Arrays User's Guide for Gene Expression Analysis. , Version 3 (2008).
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재인쇄 및 허가
