Fosfoproteomica quantitativa in acidi grassi Stimolati Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
Descrizione di una procedura di fosforilazione quantitativa, utilizzando cryolysis, solubilziation urea, frazionamento HILIC e arricchimento IMAC di peptidi fosforilati.
Abstract
Questo protocollo descrive la crescita e la stimolazione, con l'oleato di acidi grassi, degli isotopi pesanti e leggeri cellule di S. cerevisiae. Le cellule sono a terra con un procedimento cryolysis in una smerigliatrice mulino a sfere e la conseguente grindate portato in soluzione mediante solubilizzazione urea. Questa procedura permette la lisi delle cellule in uno stato metabolicamente inattivo, conservando la fosforilazione e la prevenzione riorientamento della phosphoproteome durante la lisi cellulare. Dopo la riduzione, alchilazione, tripsina digestione delle proteine, i campioni sono dissalati su colonne C18 e la complessità del campione ridotto di frazionamento mediante cromatografia di interazione idrofilica (HILIC). Colonne HILIC preferenzialmente trattenere le molecole idrofile che ben si adatta per fosfoproteomica. Peptidi fosforilata tendono ad eluire successivamente nel profilo cromatografico che le controparti non fosforilata. Dopo frazionamento, fosfopeptidi sono arricchite usando la cromatografia in metallo immobilizzato, che si basa sulla carica a base di affinità per l'arricchimento fosfopeptide. Al termine di questa procedura i campioni sono pronti per essere analizzato quantitativamente mediante spettrometria di massa.
Protocol
Discussion
Questo metodo produrrà un arricchimento di fosfopeptidi che può essere analizzato quantitativamente. Un certo numero di parametri possono essere modificati in questo protocollo, ma l'aspetto più importante da ricordare è per preservare la vostra fosforilazione. Preparazione delle cellule per la quantificazione può essere ottenuto in molti modi diversi, ad esempio se non si possono etichettare le cellule in vivo, i tag come ICAT [3] o ITRAC [4] può essere utilizzato estrazione messaggio per etichettare…
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il Dott. Rogers Ricco di assistenza tecnica con analisi di spettrometria di massa e utili discussioni, e Drs. Rob Moritz, Jeff Ranish, e Hamid Mirzai per utili discussioni.
Questo lavoro è stato finanziato dal NIH Centri di Eccellenza.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4 | Sigma-Aldrich | 608033 | ||
| Isotec™ L-Lysine-15N2 | Sigma-Aldrich | 609021 | ||
| GIBCO™ Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid | Invitrogen | 70011044 | ||
| SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | ||
| Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78420 | ||
| Retsch PM100 Ball Mill Grinder | Retsch | 20.540.0001 | ||
| Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar | Retsch | 01.462.0148 | ||
| Ultramicrospin C18 column | The Nest Group | SUM SS10 | ||
| Sep-Pak Vac 500 mg C18 | Waters | WAT043395 | ||
| TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column | TOSOH BioSciences | 13071 | This is the HILIC chromatographic column. | |
| Guard column 4.6 mm ID x1 cm | TOSOH BioSciences | 19021 | We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column. | |
| PHOS-Select™ Iron Affinity Gel | Sigma-Aldrich | P9740 | This is the IMAC resin. Aliquot and store. |
References
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