Kwantitatieve Phosphoproteomics in Fatty Acid Gestimuleerd Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
Beschrijving van een kwantitatieve fosforylering procedure met behulp van cryolysis, ureum solubilziation, HILIC fractionering en IMAC verrijking van gefosforyleerde peptiden.
Abstract
Dit protocol beschrijft de groei en stimuleren, met het vetzuur oleaat, van isotopisch zware en lichte S. cerevisiae cellen. Cellen worden gemalen met behulp van een cryolysis procedure in een kogelmolen molen en de daaruit voortvloeiende grindate gebracht oplossing van ureum oplosbaar. Deze procedure maakt het mogelijk om lysis van de cellen in een metabool inactieve toestand, met behoud van fosforylatie en het voorkomen van heroriëntatie van de phosphoproteome tijdens de cel lysis. Na de reductie, alkylering, trypsine vertering van de eiwitten, worden de monsters ontzout op C18 kolommen en het monster complexiteit verminderd door fractionering met hydrofiele interactie chromatografie (HILIC). HILIC kolommen bij voorkeur behouden hydrofiele moleculen die goed geschikt is voor phosphoproteomics. Gefosforyleerde peptiden hebben de neiging om later elueren in de chromatografische profiel dan de niet gefosforyleerde tegenhangers. Na fractionering, zijn fosfopeptiden verrijkt met behulp van geïmmobiliseerde metalen chromatografie, die zich baseert op lading op basis van affiniteit voor Phosphopeptide verrijking. Aan het einde van deze procedure de monsters zijn klaar om kwantitatief worden geanalyseerd met behulp van massaspectrometrie.
Protocol
Discussion
Deze methode levert een verrijking van fosfopeptiden die kwantitatief kunnen worden geanalyseerd. Een aantal parameters kunnen worden gewijzigd in dit protocol, maar het belangrijkste aspect om te onthouden is om het behoud van uw fosforylatie. Voorbereiding van de cellen voor de kwantificering kan worden bereikt in een aantal verschillende manieren, bijvoorbeeld als je niet kunt uw cellen label in vivo, tags zoals ICAT [3] of ITRAC [4] kan gebruikt worden na de winning tot differentieel label twee culturen voo…
Acknowledgements
We willen graag Dr Rich Rogers bedanken voor technische bijstand met massaspectrometrie analyses en behulpzaam discussies en Drs. Rob Moritz, Jeff Ranish, en Hamid Mirzai voor nuttige discussies.
Dit werk werd gefinancierd door de NIH Centers of Excellence.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4 | Sigma-Aldrich | 608033 | ||
| Isotec™ L-Lysine-15N2 | Sigma-Aldrich | 609021 | ||
| GIBCO™ Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid | Invitrogen | 70011044 | ||
| SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | ||
| Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78420 | ||
| Retsch PM100 Ball Mill Grinder | Retsch | 20.540.0001 | ||
| Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar | Retsch | 01.462.0148 | ||
| Ultramicrospin C18 column | The Nest Group | SUM SS10 | ||
| Sep-Pak Vac 500 mg C18 | Waters | WAT043395 | ||
| TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column | TOSOH BioSciences | 13071 | This is the HILIC chromatographic column. | |
| Guard column 4.6 mm ID x1 cm | TOSOH BioSciences | 19021 | We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column. | |
| PHOS-Select™ Iron Affinity Gel | Sigma-Aldrich | P9740 | This is the IMAC resin. Aliquot and store. |
References
- Albuquerque, C. P. A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).
- McNulty, D. E., Annan, R. S. Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection. Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).
- Gygi, S. P. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).
- Ross, P. L. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Gruhler, A. Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway. Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).
- Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of fission yeast. J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).
- Villen, J., Gygi, S. P. The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry. Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).
- Jensen, S. S., Larsen, M. R. Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques. Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).
- Larsen, M. R. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
- Pinkse, M. W. Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns. Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).
- Tao, W. A. Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry. Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).
- Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation. Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).
- Bodenmiller, B. Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome. Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).
