cryolysis, 요소의 solubilziation, HILIC 분류 및 phosphorylated 펩티드의 아이맥 농축을 사용하여 양적 인산화 과정에 대한 설명.
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이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜은 isotopically 무거운 가벼운 S. cerevisiae의 세포의 지방산 oleate와, 성장과 자극을 설명합니다. 세포는 볼 밀 분쇄기 및 요소의 solubilization에 의해 솔루션으로 가져온 결과 grindate에 cryolysis 절차를 사용하여 접지합니다. 이 절차는 인산화을 보존하고 세포 용해 동안 phosphoproteome의 reorientation 방지, metabolically 비활성 상태에있는 세포의 용해를 위해 수 있습니다. 감소, 알킬화, 단백질의 트립신의 소화에 따라, 샘플은 C18 컬럼과 친수성 상호 작용 크로마 토그래피 (HILIC)을 사용 분별화 감소 샘플 복잡 desalted 있습니다. HILIC 컬럼은 우선적으로 잘 phosphoproteomics 적합합니다 친수성 분자를 유지합니다. Phosphorylated 펩티드가 아닌 phosphorylated 대응보다 색층 프로필 나중에 elute하는 경향이있다. 분별화 후, phosphopeptides은 인산 농축에 대해 요금을 부과 기반의 동질성에 의존 고정화 금속 크로마 토그래피를 사용하여 풍부하게하고 있습니다. 이 절차의 뒷부분에있는 샘플은 양적 질량 분광법으로 분석 준비가 된 것입니다.
프로토콜
세포 성장 및 미디어
- 최소한의 효모 매체의 두 1리터 문화 (질산 황산이나 아미노산없이 0.17 %의 효모 질소베이스, 0.5 % 질산 황산)에 1.0 다음의 씨앗 OD 600-100 ML 리치 미디어에서 밤새 BY4742Δarg4Δlys1 세포의 단일 콜로니를 포함 (; Isotec 13 C 6 15 N 4)과 라이신 (13 C 6 15 N 2; Isotec) 20mg / isotopically 정상 또는 무거운 아르기닌의 L과 보충 아미노산의 완전한 보완합니다.
- 세포는 1.8 OD 600, 18 시간 동안 성장했다. 이것은 세포가 표시된 동위 원소의 전체 결합을 달성하기 위해 최소한 9 세대를 통과 것이 중요합니다. 가벼운 예제 매체 (isotopically 정상 아르기닌과 리신, 0.2 % Oleate (시그마 화학)와 0.5 % 트윈 40 (시그마 화학))가 포함된 oleate에 reseeded 다른 85분에 대한 자극, 멸균 물을 씻어, pelleted했다. 이것은 아르기닌과 리신과 관련하여, isotopically 빛 수율, 샘플 및....
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토론
이 방법은 양적 분석 수 phosphopeptides의 농축을 얻을 것입니다. 매개 변수의 숫자는이 프로토콜의 변경,하지만 기억에 가장 중요한 부분은 인산화를 보존하는 것입니다 수 있습니다. 당신이 그토록 ICAT와 같은 생체내, 태그에 전지를 라벨 수없는 경우 부량에 대한 세포의 준비는 예를 들어, 다른 여러 가지 방법으로 얻을 수 [3] 또는 ITRAC [4] differentially 부량 두 문화를 라벨에 게시물을 추출을 사용할 수 있습니다 목적.
분류에 대한 가장 일반적인 방법은 SDS PAGE [5, 6]에 의해 겔 분별화, SCX 크로마 토그래피 [7], 그리고 HILIC 크로마 토그래피 기초 [1, 2]. 아르 그것이 오히려 SCX하지만 다른 그룹은 다른 방법으로 좋은 성공을 이뤄 냈습니다 같이 그라디언트 앞에 eluting, 그라데이션이 끝날 때까지 펩티드를 유지하기 때문에 우리는 HILIC 선택했습니다.
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감사의 글
우리는 질량 분석계 분석과 도움이 토론과 기술 지원 박사 서식 로저스 감사하고, DRS 것입니다. 롭 모리츠, 제프 Ranish, 그리고 도움이 토론에 대한 하미드 Mirzai.
이 작품은 우수의 NIH 센터 추진하는 사업.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4 | Sigma-Aldrich | 608033 | |
| Isotec™ L-Lysine-15N2 | Sigma-Aldrich | 609021 | |
| GIBCO™ 인산염 완충 식염수(PBS) 7.4 (10X) 액상 | Invitrogen | 70011044 | |
| SigmaFAST 프로테아제 억제제 정제 | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Pierce Halt 포스파타아제 억제제 칵테일 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78420 | |
| Retsch PM100 볼 밀 그라인더 | Retsch | 20.540.0001 | |
| Retsch 125 ml 스테인리스 스틸 그라인딩 자 | Retsch | 01.462.0148 | |
| Ultramicrospin C18 컬럼 | The Nest Group | SUM SS10 | |
| Sep-Pak Vac 500 mg C18 | Waters | WAT043395 | |
| TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm 분석용 컬럼 | Tosoh Corp. | 13071 | HILIC 크로마토그래피 컬럼입니다. |
| 가드 컬럼 4.6 mm ID x1 cm | Tosoh Corp. | 19021 | HILIC 컬럼의 수명을 연장하기 위해 이 가드 컬럼을 사용할 것을 권장합니다. |
| PHOS-Select™ 철 친화성 겔 | Sigma-Aldrich | P9740 | IMAC 레진입니다. 소분하여 보관하십시오. |
참고문헌
- Albuquerque, C. P. A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).
- McNulty, D. E., Annan, R. S. ....
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재인쇄 및 허가
