Описание процедуры количественного фосфорилирования использованием криодеструкция, мочевина solubilziation, HILIC фракционирования и IMAC обогащения фосфорилированных пептиды.
Abstract
Этот протокол описывает роста и стимулирования, с жирной олеиновой кислоты, изотопно-тяжелой и легкой клетки С. CEREVISIAE. Клетки местности с помощью криодеструкции процедура в мясорубку шаровой мельнице и в результате grindate приведены в растворе мочевины солюбилизации. Эта процедура позволяет лизис клетки в метаболически неактивное состояние, сохраняя фосфорилирования и предотвращения переориентации phosphoproteome во время клеточного лизиса. После сокращения, алкилирования, трипсина переваривание белков, образцы обессоленной на C18 колонны и образец сложности сократились на фракционирования использованием гидрофильной хроматографии взаимодействия (HILIC). HILIC колонн преимущественно сохраняют гидрофильных молекул, которые хорошо подходят для phosphoproteomics. Фосфорилированных пептиды, как правило, элюируются позднее в хроматографического профиля, чем не фосфорилированных аналогов. После фракционирования, фосфопептиды обогащенного использованием иммобилизованных металла хроматографии, которая опирается на заряд основе сродство к фосфопептидов обогащения. В конце этой процедуры образцы готовы к количественному анализу методом масс-спектрометрии.
Protocol
Клеточного роста и средств массовой информации Единственная колония BY4742Δarg4Δlys1 клетки на ночь в 100 мл богатых СМИ OD 600 на 1,0, то семя на две 1 л культур минимальной среде дрожжи (0,17% Дрожжи азотистого основания, без сульфата аммония или аминокислот, 0,5% сульфат аммония), соде…
Discussion
Этот метод даст обогащение фосфопептидов, которые могут быть количественный анализ. Число параметров может быть изменен в данном протоколе, но самый важный аспект помнить, чтобы сохранить свои фосфорилирования. Подготовка клеток для количественной может быть достигнуто в несколько р…
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Богатые Роджерс для оказания технической помощи с масс-спектрометрии анализа и полезные обсуждения, и д-ра. Роб-Мориц, Джефф Ranish, и Хамид Mirzai за полезные обсуждения.
Эта работа финансировалась NIH Центры компетенции.
Saleem, R. A., Aitchison, J. D. Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (32), e1474, doi:10.3791/1474 (2009).