一个<em在体外 FluoroBlok肿瘤侵袭实验

Summary

本视频演示了如何来衡量使用荧光为基础的方法，通过细胞培养插入细胞的侵袭。

Abstract

转移性细胞的特点是通过基底膜侵入的能力，并迁移到身体的其他部位。细胞必须能够同时打破基底膜以及以侵入迁移的分泌蛋白酶。屋宇署BioCoat肿瘤浸润系统提供了条件，使他们的侵入财产的评估细胞<em>在体外</em^1,2。它由一个BD猎鹰FluoroBlok 24 8.0微米孔径的PET膜已与BD基质胶基质涂层均匀的多孔插板式。这一层BD基质胶基质的统一作为一个重组基底膜<em>在体外</em>提供一个非侵入性的细胞真正障碍，同时提出了相应的的蛋白质结构研究入侵。涂层工艺的膜阻塞的毛孔，阻止非侵入性的细胞通过膜迁移。相比之下，侵入细胞能够分离并通过涂层膜迁移。定量细胞的侵袭，可以实现前或后细胞的侵袭标签与介质隔离集成电路，如荧光染料₁₂（3）或钙黄绿素上午，分别与测量侵入细胞的荧光。由于屋宇署FluoroBlok膜有效地阻止> 99％的效率从490-700 nm的光通过，荧光标记的细胞没有入侵未检测到一个自下而上的阅读荧光酶标仪。然而，已侵入细胞的膜底面不再屏蔽光源，并与各自的酶标仪检测。本视频演示了一个端点细胞侵袭实验，采用钙黄绿素AM检测入侵的细胞。

Protocol

贴标签和测量使用屋宇署钙黄绿素AM荧光染料被标记的定量细胞后，他们通过BD基质胶矩阵侵略，并通过BD FluoroBlok膜。因此，只有端点测量细胞的侵袭可能获得。 种植细胞〜80％汇合。 插入系统的准备和补充水分。 从-20 ° C储存取出包，并允许它来室温。 打开铝箔包，并添加500μL，温（37 ° C）媒体插入井内部。允许板2小时补充水分，在37 ° C，5％的CO 2 。 注 ：这是没有必要补充水分涂层BD猎鹰FluoroBlok 24多孔插入系统将作为一个细胞迁移控制。 补液后，小心取出从插入井的介质膜，而不会干扰BD基质胶基质层。现在可以使用该系统。 准备trypsinizing细胞单层和resuspending在5 × 10 4细胞/ ml的细胞在无血清DMEM细胞悬液。 注 ：如果您使用的是不同的细胞类型，你需要，以确定最佳的播种密度。要确定一种多孔的表面生长的细胞类型的最佳播种密度，播种密度使用范围（细胞/ 厘米 2），括号内的无孔的表面上使用的播种密度（即瓶，餐具和盘子）。例如，如果你目前在2.5 × 10 5细胞/厘米2，种子在不同的细胞浓度之间的种子5 × 10 4和5 × 10 5细胞/平方厘米，以确定最佳的初始播种密度。 加入500μL的细胞悬液（2.5 × 10 4细胞）的根尖商会。 每个基底商会添加750μL的趋化因子（在DMEM 5％胎牛血清），使用访问样本端口。 孵育屋宇署BioCoat肿瘤浸润系统和涂层BD猎鹰FluoroBlok 24多孔20-22小时的插入板在37℃，5％的CO 2气氛。 潜伏期之后，小心地取出介质从心尖部室。这可以弹成一个废物容器的内容。请勿触摸插入系统的底部表面。 转移到第二个24孔板含有500μL/孔，4微克/毫升钙黄绿素AM在HBSS中插入系统。 1个小时，在37℃，5％的CO 2 。从下腔前阅读荧光钙黄绿素我的解决方案是不会被删除，因为它是一个nonfluorescent重要的染料，是转换成绿色荧光钙黄绿素细胞质酯酶。 读取侵入细胞的荧光波长五百十七分之四百九十四纳米自下而上的阅读荧光酶标仪（EX / EM）。增益设置，可能需要凭经验确定，但中点增益应该有足够的起点。一个增益设置过高可能会导致高荧光样品的检测器的饱和度，这可能会阻止取得有意义的结果。 autogain使用（如果你的读者支持）是不推荐使用。倒置荧光显微镜，可以用来验证你的结果;，这样做你第一次运行这个实验，它是特别有用。 注意 ：它最重要的是使用正确的板图，插入系统是只读的。加载板图的信息中看到BD技术公告第436号www.bdbiosciences.com或联络屋宇署技术支持（labware@bd.com）。正确板的方向是在左上角和屋宇署Flacon标志导向，以正确的孔A1板插入到读者。 数据减少数据是在下面的公式表示为： 背景可能会被减去之前计算％细胞的侵袭 RFU =相对荧光单位。

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
BD BioCoat Tumor Invasion System		BD Biosciences	354165 or 354166
HT-1080 and NIH/3T3 cells		ATCC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS)
BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control		BD Biosciences	351157 or 351158
5% Fetal Bovine Serum in DMEM
BD Calcein AM Fluorescent Dye		BD Biosciences	354216 or 354217
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)
BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling		BD Biosciences	351147
Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities		PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.