Un In vitro Tumor FluoroBlok invasión de ensayo

Summary

Este video muestra la forma de medir la invasión de las células a través de insertos de cultivo celular utilizando una metodología basada en fluorescencia.

Abstract

La característica distintiva de las células metastásicas es su capacidad para invadir a través de la membrana basal y migrar a otras partes del cuerpo. Las células deben ser capaces de secretar tanto proteasas que rompen la membrana basal, así como la migración con el fin de ser invasivo. BD tumor BioCoat Sistema invasión provee a las células con las condiciones que permitan la evaluación de sus propiedades invasivas<em> In vitro</em^1,2. Se trata de un FluoroBlok BD Falcon 24 Multiwell Plate de Inserción con una membrana de 8,0 micras de poro PET tamaño que ha sido uniformemente cubierto con BD Matrigel matriz. Esta capa uniforme de BD Matrigel matriz sirve como una membrana basal reconstituida<em> In vitro</em> Ofrecer una verdadera barrera para no invasiva, mientras que las células que presentan una estructura de la proteína adecuada para estudiar la invasión. El proceso de recubrimiento obstruye los poros de la membrana, el bloqueo no invasiva las células migren a través de la membrana. En contraste, las células invasoras son capaces de desprenderse de y migran a través de la membrana de recubrimiento. La cuantificación de la invasión de células se puede lograr ya sea por invasión de etiquetado antes o después de las células con un tinte fluorescente como DiIC₁₂ (3) o calceína AM, respectivamente, y la medición de la fluorescencia de las células invasoras. Ya que la membrana BD FluoroBlok efectivamente bloquea el paso de la luz desde 490 hasta 700 nm con una eficiencia> 99%, con fluorescencia células marcadas que no han invadido no son detectados por un lector de placas de abajo a la lectura de fluorescencia. Sin embargo, las células que han invadido a la parte inferior de la membrana ya no están protegidos de la fuente de luz y son detectados con el lector de placas respectivas. Este video muestra una celda de punto final de la invasión de ensayo, utilizando calceína AM para detectar células invadidas.

Protocol

Post-etiquetado y la medición con BD calceína AM tinte fluorescente Las células están etiquetados para la cuantificación después de haber invadido a través de la matriz BD Matrigel y pasa a través de la membrana BD FluoroBlok. Como resultado, sólo medición de la variable de la invasión de células se pueden obtener. Se cultivan las células en la confluencia ~ 80%. Preparar y rehidratar el sistema de inserción. Retire el paquete de -20 ° C de almacenamiento y permitir que llegue a temperatura ambiente. Abra el paquete de aluminio y añadir 500 l tibia (37 ° C) los medios de comunicación al interior de los pozos de inserción. Dejar la placa para rehidratar durante 2 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. Nota: No es necesario rehidratar la BD Falcon sin recubrimiento FluoroBlok 24 Multiwell sistema de inserción que se utilizará como control de la migración celular. Después de la rehidratación, retire con cuidado el medio de los pozos de inserción sin afectar la capa de BD Matrigel matriz de la membrana. El sistema está ahora listo para usar. Preparar las suspensiones de células por trypsinizing monocapas de células y resuspender las células en DMEM libre de suero de 5 x 10 4 células / ml. Nota: Si utiliza un tipo de células diferentes que usted necesita para determinar la densidad de siembra óptima. Para determinar la densidad de siembra óptima para su tipo de célula en una superficie porosa crecimiento, utilizan una gama de densidades de siembra (células / cm 2) que pone entre paréntesis la densidad de siembra utilizado en superficies no porosas (por ejemplo, frascos, platos y bandejas). Por ejemplo, si actualmente las semillas de 2,5 x 10 5 células / cm 2, la semilla en las concentraciones de células, entre 5 x 10 4 y 5 x 10 5 células / cm 2 para determinar la densidad óptima de siembra inicial. Añadir 500 l de suspensión de células (2,5 x 10 4 células) de las cámaras apical. Añadir 750 l de quimioatrayente (5% de SFB en DMEM) a cada una de las cámaras basal, utilizando los puertos de muestreo para el acceso. Incubar la BioCoat BD tumor del sistema y la invasión sin recubrimiento BD Falcon FluoroBlok 24 Multiwell Plate de Inserción de 20-22 horas a 37 ° C, 5% de CO2 la atmósfera. Después de la incubación, retire con cuidado medio de las cámaras apical. Esto se puede lograr simplemente accionando el contenido en un recipiente de residuos. No toque la superficie inferior del sistema de inserción. Transferir el sistema de insertar en un segundo 24 y placa con 500 l / pocillo de 4 mg / mL calceína AM en HBSS. Incubar durante 1 hora a 37 ° C, 5% de CO 2. La solución calceína AM no se elimina de la cámara baja antes de la lectura de fluorescencia, ya que es un colorante no fluorescente vital que se convierte en calceína verde fluorescente por las esterasas citosólicas. Fluorescencia de las células invadidas se lee en longitudes de onda de 494/517 nm (Ex / Em) en un lector de placas de abajo hacia la lectura fluorescente. El ajuste de la ganancia posible que tenga que ser determinada empíricamente, pero una ganancia del punto medio debe ser un punto de partida suficiente. Un ajuste de la ganancia que es demasiado alto puede conducir a la saturación del detector con una muestra altamente fluorescente, lo que puede impedir la adquisición de resultados significativos. El uso de AutoGain (si es compatible en el lector) no es recomendable. Un microscopio de fluorescencia invertido se puede utilizar para comprobar los resultados, es especialmente útil para ello la primera vez que ejecute esta prueba. Nota: Es de suma importancia que los sistemas de inserción se leen con el mapa de la placa correcta. Para obtener información sobre mapas de placa de carga BD ver Boletín Técnico N º 436 de www.bdbiosciences.com o póngase en contacto con BD de Apoyo Técnico (labware@bd.com). Orientación de la placa adecuada es con el pocillo A1 en la esquina superior izquierda y el logotipo de BD Flacon orientada a la derecha de la placa se introduce en el lector. Reducción de datos Los datos se expresan como en la siguiente ecuación: De fondo se puede restar antes de la invasión de cálculo del porcentaje de células RFU = fluorescentes unidades relativas.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
BD BioCoat Tumor Invasion System		BD Biosciences	354165 or 354166
HT-1080 and NIH/3T3 cells		ATCC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS)
BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control		BD Biosciences	351157 or 351158
5% Fetal Bovine Serum in DMEM
BD Calcein AM Fluorescent Dye		BD Biosciences	354216 or 354217
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)
BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling		BD Biosciences	351147
Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities		PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.