वायरल फ्यूजन कैनेटीक्स के मापन के लिए एकल कण स्तर पर विधि
Summary
हम एक वर्तमान<em> इन विट्रो में,</em> दो रंग प्रतिदीप्ति परख के लिए एक द्रव लक्ष्य bilayer के साथ एकल वायरस कणों के संलयन कल्पना. Fluorophores है कि विभिन्न वायरल झिल्ली और अपनी आंतरिक दाग के साथ वायरल कणों लेबलिंग करके, हम hemifusion और ताकना गठन के कैनेटीक्स की निगरानी करने में सक्षम हैं.
Abstract
झिल्ली संलयन छा वायरस की कोशिकाओं में प्रवेश के दौरान एक आवश्यक कदम है. परम्परागत संलयन assays आमतौर पर संलयन घटनाओं की एक बड़ी संख्या पर रिपोर्ट, यह मुश्किल मात्रात्मक आणविक शामिल कदम के अनुक्रम का विश्लेषण कर रही है. हम इन विट्रो में एक विकसित किया है, दो रंग प्रतिदीप्ति परख के लिए अनिवार्य रूप से एक तरल पदार्थ के समर्थन पर एक लक्ष्य bilayer के साथ एक वायरस कणों fusing के कैनेटीक्स की निगरानी.
इन्फ्लुएंजा वायरल कणों एक हरे रंग की lipophilic झिल्ली और एक लाल हाइड्रोफिलिक fluorophore वायरल इंटीरियर दाग दाग fluorophore के साथ incubated हैं. हम dextran functionilized एक प्रवाह कक्ष के कांच की सतह पर एक लिपिड ganglioside युक्त bilayer जमा, planar bilayer और एक 100 x 100 सुक्ष्ममापी 2 क्षेत्र के प्रतिदीप्ति छवि पर वायरल कणों को सेते हैं, जिसमें कणों की एक सीसीडी पर कई सैकड़ों , कैमरा. इमेजिंग दोनों लाल और हरे रंग प्रतिदीप्ति करके, हम एक साथ झिल्ली (हरा) डाई और कणों के जलीय सामग्री (लाल) के व्यवहार की निगरानी कर सकते हैं.
संलयन पीएच नीचे एक मूल्य के लिए पीएच कम होने पर, कणों झिल्ली के साथ फ्यूज होगा. Hemifusion, लक्ष्य झिल्ली की बाहरी पत्रक के साथ वायरल झिल्ली के बाहरी पत्रक के विलय, एक कण की हरी प्रतिदीप्ति में अचानक परिवर्तन के रूप में दिखाई देगा. दो शेष बाहर का पत्रक के बाद संलयन करने पर एक ताकना और गठन किया जाएगा वायरल कण में fluorophore लाल उत्सर्जन लक्ष्य झिल्ली के तहत जारी किया जाएगा. इस घटना को व्यक्तिगत कणों के लाल प्रतिदीप्ति की कमी को जन्म दे देंगे. अंत में, एक fluorophore पीएच प्रति संवेदनशील है कि लक्ष्य झिल्ली में एम्बेडेड है से एकीकृत प्रतिदीप्ति पीएच बूंद का सही समय पर रिपोर्ट.
तीन प्रतिदीप्ति समय निशान से सभी महत्वपूर्ण घटनाओं (पीएच ड्रॉप, hemifusion, ताकना गठन पर मिश्रण सामग्री पर मिश्रण लिपिड) अब एक सरल तरीके से और हर कण के लिए व्यक्तिगत निकाला जा सकता है. हिस्टोग्राम में कई व्यक्तिगत कणों के लिए विभिन्न संक्रमण के लिए elapsed समय एकत्रित करके, हम इसी मध्यवर्ती जन्मों के निर्धारित कर सकते हैं. यहां तक कि छिपा मध्यवर्ती है कि एक प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट नमूदार नहीं है इन histograms से सीधे कल्पना कर सकते हैं.
Protocol
Discussion
तरल पदार्थ और सतत समर्थित लिपिड bilayers की तैयारी चुनौतीपूर्ण हो सकता है. सामग्री या सतह दोष contaminating के ट्रेस मात्रा bilayers के प्रसार को रोकने जाएगा. सावधानी से सफाई और dextran के एक समान परत के बयान के लिए आवश्यक हैं. </p…
Acknowledgements
काम NIH अनुदान (SCH के लिए) AI57159 और AI72346 (AMvO के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था. SCH एक हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट अन्वेषक है.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Corning cover glass squares, 25 mm | Sigma | CLS286525 | ||
| Fused silica slides | Technical Glass | |||
| Staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | ||
| (3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane | Gelest | SIG5840.1 | ||
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | ||
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti | 850375 | ||
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti | 850457 | ||
| Cholesterol | Avanti | 700000 | ||
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | ||
| Streptavidin, fluorescein conjugate | Invitrogen | S-869 | ||
| Disialoganglioside GD1a from bovine brain | Sigma | G2392 | ||
| Mini Extruder | Avanti | 610000 | ||
| 0.1 micron polycarbonate membrane filters | Whatman | 800309 | ||
| 10 mm drain discs (membrane supports) | Whatman | 230300 | ||
| Sulforhodamine b sodium salt | S1402 | |||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol | |||
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | ||
| Nikon fluorescence microscope | Nikon | TE2000-U | ||
| Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective | Nikon | |||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser | Coherent | |||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702213 |
References
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
